米非司酮对人宫颈癌HeLa细胞生长及其NF-κB p65表达的影响

　　作者：陆晓媛，魏 敏 作者单位：徐州医学院附属医院妇产科，江苏徐州

　　【摘要】 目的 探讨米非司酮(mifepristone,MIF)对人子宫颈癌HeLa细胞增殖及其NF-κB p65蛋白表达水平的影响。方法 体外培养人子宫颈癌HeLa细胞，采用MTT法观察不同浓度MIF(5、10、20 μmol/L)对HeLa细胞增殖的抑制作用;采用Western blot法检测MIF对HeLa细胞中NF-κB p65蛋白表达水平的影响。结果 3个浓度的MIF均能显著抑制HeLa细胞的增殖，呈剂量依赖性;MIF可以使HeLa细胞中NF-κB p65蛋白表达水平下降。结论 MIF对宫颈癌HeLa细胞体外生长具有明显的抑制作用，并且下调HeLa细胞NF-κB p65蛋白的表达。

　　【关键词】 宫颈肿瘤;人宫颈癌HeLa细胞株;米非司酮;核因子-κB p65

　　Effects of mifepristone on the growth and the expression of NF-κB p65

　　of human cervical carcinoma cell line HeLa

　　LU Xiaoyuan, WEI Min

　　(Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,

　　Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To investigate the effect of mifepristone on cell proliferation and the expression of NF-κB p65 of human cervical carcinoma cell line HeLa. Methods Human cervical cancinoma cell line HeLa was cultured in vitro. The antiproliferation effects of three different concentrations of mifepristone (5, 10 and 20 μmol/L) on HeLa cell line were detected with MTT assay. Western blot method was performed to examine the effect of mifepristone on the expression of NF-κB p65 protein of HeLa cell line. Results Three different concentrations of mifepriston inhibited the proliferation of HeLa cells in a dose-depending manner. The inhibition by mifepristone reached a plateau at 20 μmol/L. The expression of NF-κB p65 was reduced by mifepristone in HeLa cells. Conclusion Mifepristone has a significant inhibition effect on the growth of cervical carcinoma cell line HeLa in vitro and can down-regulate the expression of NF-κB p65 protein of HeLa cell line.

　　Key words: cervix neoplasms; human cervical carcinoma cell line HeLa; mifepristone; NF-κB p65

　　米非司酮(mifepristone,MIF)是20世纪80年代由法国Roussel Uclaf药厂人工合成的抗孕激素药物，目前在临床上主要用于终止早孕、引产等。但近年研究发现，MIF还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等其他临床新用途;核因子-κB (nuclear factor κB,NF-κB)是一种具有多向调节功能的核转录因子，它参与细胞的增殖、凋亡和癌基因的转录调控，并被证实和宫颈癌的发生发展密切相关[1-2]，NF-κB p65则是NF-κB在体内发挥生理功能的主要亚单位之一。目前，关于MIF对人宫颈癌HeLa细胞生长影响及其与NF-κB p65蛋白表达的关系尚少见报道，为此我们设计了此实验，研究不同浓度的MIF对人宫颈癌HeLa细胞生长及其NF-κB p65蛋白表达的影响，探讨MIF对宫颈癌的治疗作用及其可能的作用机制，为宫颈癌的防治寻找新途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人宫颈癌HeLa细胞株(中国医学科学院血液病研究所，天津);MIF纯粉剂(浙江仙琚制药股份有限公司);DMEM干粉(美国Gibco公司);MTT(美国Amersco公司);NF-κB p65抗体(碧云天生物技术研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 常规复苏冻存的宫颈癌HeLa细胞，接种于盛有DMEM培养液(含10%胎牛血清、105 U/L青霉素、105 U/L链霉素)的培养瓶中，细胞于培养液中在37℃、体积分数5% CO2、饱和湿度培养箱内培养，隔日更换新培养液1次。平均3～4天传代1次。

　　1.2.2 实验分组 将培养的HeLa细胞随机分为用药组和对照组。用药组：分为3个剂量组(n=6)，分别含有浓度为5、10、20 μmol/L的MIF，各组DMEM培养液中乙醇终浓度小于0.2%，含有7%胎牛血清。对照组(n=6)：培养液中不含MIF，只含与用药组相同浓度的乙醇和胎牛血清。

　　1.2.3 MTT法检测MIF对HeLa细胞增殖的影响 收集对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，以每孔8000个细胞接种到96孔培养板中，24 h后观察细胞已贴壁，分组施加药物干预。分组情况如上所述，每组设6个平行孔，继续培养72 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μl二甲亚砜，低速振荡30 min，用酶标仪在492 nm处测定光密度(D值)。按下列公式计算抑制率：

　　抑制率=(1-用药组D值/对照组D值)×

　　100%。

　　1.2.4 Western blot法检测NF-κB p65的表达 取对数生长期的HeLa细胞，制成单细胞悬液，以每孔8×105个细胞接种于6孔培养板中，24 h后观察细胞已贴壁，分组施加药物干预。分组情况如上所述，每组重复3个孔，继续培养72 h，收集细胞，按一种新改进的核蛋白的抽提方法[3]提取核蛋白。将核蛋白提取液进行蛋白浓度测定后，依次行SDS-PAGE电泳、半干转膜、抗原-抗体反应、显色，拍照。实验过程中，以β-actin作为内参进行检测，保证实验结果的准确性。最后用Image J 图像分析软件对条带进行分析，测定其灰度值。NF-κB p65条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值即为NF-κB p65蛋白相对含量。

　　1.3 统计学处理 应用SigmaStat 2.03统计学软件对结果进行统计分析，各组数据以±s表示，采用单因素方差分析(one-way ANVOA)，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MIF对HeLa细胞生长的影响 MTT法结果显示，与对照组相比，3种浓度的MIF作用72 h后均抑制了宫颈癌HeLa细胞的增殖，抑制率随MIF剂量的增加而增加，作用呈剂量依赖性;用药各剂量组与对照组相比以及用药各剂量组之间两两比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)。见表1。表1 MIF对HeLa细胞增殖的影响 用药各剂量组与对照组比较及用药组间两两比较：P<0.01

　　2.2 MIF对HeLa细胞NF-κB p65表达的影响 Western blot结果显示，各组细胞中β-actin蛋白的表达量基本相同，表明各组样品蛋白上样量基本一致;用药组NF-κB p65蛋白相对表达量均明显低于对照组(P<0.01);随着药物浓度的增加，MIF对NF-κB p65蛋白表达下调作用明显增强，且用药各剂量组之间的差异均具有统计学意义(P<0.01)。见图1、表2。

　　3 讨 论

　　3.1 MIF对HeLa细胞体外生长抑制作用 MIF是目前惟一用于临床的孕激素受体拮抗剂，临床上主要用于终止早中期妊娠等。近年来，随着研究的不断深入，发现MIF还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等新用途。目前，已有用MIF治疗子宫肌瘤[4]、子宫内膜癌[5]和卵巢癌[6]的报道，而且研究发现，MIF对孕激素受体(progesterone receptor,PR)阳性和PR阴性的卵巢癌细胞系均具有明显的生长抑制作用[6]。这意味着PR并不是MIF抗肿瘤细胞增殖的必需要素，MIF除作为PR拮抗剂发挥抗肿瘤作用外，还可以通过其他途径抑制肿瘤的生长。

　　分子生物学研究显示，宫颈癌的发生、发展与人乳头状病毒(human papilloma virus,HPV)，特别是高危型HPV感染密切相关[7]。近年研究发现，类固醇激素如雌激素、孕激素能上调HPV基因的表达，促进宫颈癌的发生发展，而MIF能通过阻断类固醇激素的作用，抑制HPV基因的表达，从而抑制HPV阳性的宫颈癌细胞的生长[8-9]。

　　本实验发现不同浓度的MIF(5、10、20 μmol/L)作用于宫颈癌HeLa细胞72 h后，均能抑制细胞的生长，抑制率分别为22.95%、33.49%、46.61%，呈剂量依赖性,说明MIF对宫颈癌HeLa细胞体外生长具有明显的增殖抑制作用。

　　3.2 MIF对子宫颈癌HeLa细胞NF-κB p65表达的影响 临床和基础研究显示，诱导肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤生长、提高肿瘤细胞对化疗和放疗敏感性的关键所在。近年来一些学者发现NF-κB在调节细胞凋亡中起着重要作用，并与肿瘤的发生、浸润和转移关系密切。正常情况下，NF-κB在胞质内与抑制性蛋白(IκBα、IκBγ、Bcl-3等)结合，以无活性状态存在于胞质中;但当有刺激因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、生长因子、放射线、一些细胞毒性药物、病毒和细菌等作用时，可激活NF-κB系统，活化的NF-κB则转位进入细胞核，调控相关基因的转录和表达，且具有多向转录调节功能。NF-κB p65是NF-κB在体内发挥生理功能的亚单位之一[10]。因此，抑制NF-κB活化，下调NF-κB p65表达，可抑制肿瘤的生长并提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物和放射线介导的凋亡的敏感性。研究发现，MIF对NF-κB的调节作用以及NF-κB对细胞凋亡的调节作用具有细胞特异性，并与不同的刺激因素有关[11]。

　　研究发现，NF-κB在宫颈癌组织中高表达并与宫颈癌的发生和发展密切相关[11]。本研究采用Western blot方法分析不同浓度的MIF对人子宫颈癌HeLa细胞核蛋白中NF-κB p65蛋白表达的影响，结果显示，与对照组相比，3种浓度的MIF均能下调NF-κB p65蛋白的表达，其作用呈剂量依赖性。

　　综上所述，我们认为，MIF具有抑制人宫颈癌细胞生长、抑制NF-κB活化和下调NF-κB p65蛋白表达的功能;抑制NF-κB活化与下调NF-κB p65蛋白表达可能是MIF抑制HeLa细胞生长的机制之一。MIF口服耐受性良好，不良反应小，有望成为临床上治疗宫颈癌的有效药物或提高放疗、化疗敏感性的辅助用药，但是其确切的抗肿瘤作用机制，尚需进一步研究探讨。而且，MIF对宫颈癌的确切疗效和适用性尚需通过体内实验(包括动物实验和临床实验)进一步研究。

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