D3S1289、D5S406、D6S277微卫星不稳定性与子宫颈癌的相关性

　　作者：石淑贤 耿力 (包头医学院第一附属医院妇产科，内蒙古 包头 014010)

　　摘 要 目的: 探讨微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)与子宫颈癌的相关性。方法:22例子宫颈浸润性鳞癌石蜡标本，选取3、5和6号染色体上的3个微卫星位点D3S1289、D5S406、D6S277进行MI分析。结果:在子宫颈癌标本中3个位点均未发现MI和杂合性缺失(LOH)的改变。结论:3个微卫星位点未见MI和LOH的改变，可能与病例少、位点少、种族及取样有关。

　　关键词 子宫颈癌;微卫星不稳定性

　　A Study of Microsatellite Instability in Cervical Cancer

　　SHI Shuxian,GENG Li

　　(The First Hospital of Baotou Medical College,Baotou 014010,China)

　　Abstract Objective:To investigate microsatellite instability (MI) in cervical cancer. Methods: MI of 3 microsatellite markers were detected in 22 invasive squamous cancers and self normal cervix.Results: MI and loss of heterozygosity(LOH) were not detected in D3S1289，D5S406，D6S2773 in 22 cervical cancers. Conclusions: The results of MI analysis were negative, may be related with less cases and microsatellite markers、races and clinician-collected cervical samples.

　　Key words Cervical cancer;Microsatellite instability

　　子宫颈癌是严重影响世界妇女健康的常见恶性肿瘤,占女性生殖道恶性肿瘤的首位。近年发病呈上升趋势并且年轻化[1]。巴氏涂片防癌普查应用久远，但影响因素较多，最终诊断需靠病理检查。微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)是近年来发展起来的用于检测肿瘤组织的一种新标志。研究表明MI仅存在肿瘤组织中，有可能成为检测肿瘤的早期分子标志。MI常用的分析方法是PCR-聚丙烯酰胺变性凝胶电泳及银染，应用该方法能快速有效地检测出MI和杂合性缺失(Loss of heterozygosity, LOH)。本文对子宫颈癌的微卫星不稳定性进行3个位点的研究。

　　1材料与方法

　　1.1 材料22例子宫颈浸润性鳞癌标本来自北京大学第三医院病理科1997-2002年间的存档石蜡标本，由病理科医师复核诊断。术前均未接受过放射治疗、化学治疗和激素治疗，年龄31～65岁。临床分期按FIGO分期，Ⅰ期11例，Ⅱ期8例，Ⅲ期3例。

　　1.2基因组DNA的提取采用显微切割法提取基因组DNA：石蜡包埋组织连续切片5μm厚，HE染色，光镜下由病理科医师标出病变部位，分别获取肿瘤组织和正常组织，二甲苯脱蜡，蛋白酶K 56℃过夜消化，酚仿抽提，紫外分光光度计定量，-20℃贮存。选用β-Actin引物(购自鼎国生物工程公司)进行PCR扩增(序列为5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3’，5’CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3’)，检验基因组DNA提取的是否成功。PCR反应条件：95℃45秒，54℃30秒,72℃30秒,35个循环。PCR产物300bp，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.3微卫星不稳定性检测选用3个微卫星标记：D3S1289,3p21.2-p21.1，序列为5’AAAGCAACTTGTAAGAGAGC 3’，5’ACTCCTAGATATAATCACTGG 3’;D5S406，5p15.1-p15.2,序列为5’CCTGCCAATACTTCAAGAAA 3’，5’GGGATGCTAACTGCTGACTA 3’;D6S277，6p24-p23，序列为5’AGCTGAATAACACGCAGGTG 3’，5’ATTTTTGATGACAATGGAATGC 3’，由美国国立癌症研究所JinJen教授馈赠。PCR反应体系25μl, DNA模板1μl，上、下游引物各10pmol，10×PCR缓冲液2.5μl, 200μmol/ldNTPs 1μl，TaqDNA聚合酶1U(购自华美生物工程公司)。反应条件：94℃预变性5分钟，94℃60秒，53～57℃60秒,72℃60秒,35个循环。取2μl PCR反应产物，与等量上样缓冲液(95%甲酰胺，10mmol/L EDTA,0.1%二甲苯青，0.1%溴酚蓝)混合，混合物95℃变性5分钟后于冰上上样于6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(含7mol/L尿素)，在40℃、600V电泳3.5小时后银染，观察结果。

　　1.3结果判断将肿瘤组织与相应的正常组织DNA的PCR产物成对上样并同时比较，若肿瘤组织的某一等位基因条带与非肿瘤组织的相应条带比较完全消失或相对密度减少50%以上，则判为LOH;若肿瘤组织与非肿瘤组织相比条带发生移位或增加，则为MI。

　　2 结果

　　基因组DNA提取鉴定：22例子宫颈癌标本中癌组织及自身正常组织，经用β-Actin引物进行PCR扩增，证实基因组DNA提取成功。

　　微卫星不稳定性检测： 22例子宫颈癌组织及自身正常组织于3个微卫星位点D3S1289、D5S406、D6S277均未见微卫星不稳定性和杂合性缺失的改变。

　　3 讨论

　　微卫星DNA是短小串联重复序列(STR)，重复单位一般为2～6个核苷酸，在人类基因组中广泛存在，在人群中表现为高度多态性。微卫星不稳定性(MI)是指实质肿瘤组织与其相应的正常组织DNA结构性等位基因的大小发生了改变。微卫星不稳定性最初是在研究HNPCC中发现并成为胃肠道发病的一种新机制，之后陆续在很多肿瘤中均有发现。MI用于检测肿瘤已成为一种新的途径。LiMao等率先将MI用于膀胱癌的研究中，早期诊断阳性率95%，明显高于细胞学检测50%。另外肺小细胞癌、头颅鳞癌等的MI检测率也很高。有关子宫颈癌微卫星不稳定性的研究国外已有报道，结果不一，有些人认为MI在子宫颈癌发病中是一早期事件;有些则认为是一晚期或稀有事件。国内报道少。

　　本研究选取了3个国外报道MI和LOH发生频率较高(48%～75%)的位点进行了微卫星DNA检测，但均未发现改变。分析原因可能为：第一，样本量小，尚不能定论。第二，微卫星位点众多5 000个以上，寻找中国人特异的微卫星标记，还需进行其他位点的检测。虽然国内有报道MI在子宫颈癌中发生频率较高[2，3]，但彼此选取的微卫星位点不一样，所以没有可比性。第三，我们所选的3个位点均是根据国外资料报道，是否微卫星DNA的改变存在种族差异[4]，还有待于进一步研究。第四，我们所选用的子宫颈癌组织和正常组织均是从同一张石蜡切片上刮出的，只要显微镜下观察细胞形态正常及认为是正常组织。但从分子水平这个角度考虑这些正常组织是否已发生潜在的癌变，还需要进一步研究。这提示我们正常对照最好选择外周血或远离癌组织的正常组织，以防实验有误。

　　寻找并确定子宫颈癌的MI位点对于子宫颈癌的诊断和治疗均具有重要意义，微卫星不稳定性与子宫颈癌的相关性尚需做进一步的研究。

　　参考文献

　　[1] Parkin DM, Bray F, Ferlay J,et al. Estimating the world cancer burden :globocan 2000 [J].Int J Cancer ,2001，94：153

　　[2] 温培娥，崔树龄，刘乃富，等.微卫星不稳定性和杂合性丢失与宫颈癌相关性的研究[J].肿瘤防治杂志，2000，7(4)：377

　　[3] 赵,伍欣星.宫颈癌3、6、11和18号染色体遗传不稳定性的研究[J].癌症,2002,21(6):640.

　　[4] 范振斌，白谨峰，程书钧.中国人膀胱癌微卫星不稳定性改变的研究进展[J].中国肿瘤,1999,8(1)：35.