Caspase3、Bcl-2蛋白在胎盘组织中的表达及其与羊水过少的相关性研究

　　作者：高丽萍，孙丽洲，隋灿烂，贾政伟，缪玉梅，吕爱远 作者单位：(1.南京医科大学第一附属医院妇产科，江苏南京210029;2.徐州市第三人民医院妇产科，江苏徐州221005)

　　【摘要】 目的 探讨胎盘组织中凋亡蛋白Caspase3、凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达及其与羊水过少的相关性。方法 采用免疫组化法检测羊水过少30例(羊水过少组)和正常产妇30例(对照组)胎盘滋养细胞Caspase3、Bcl-2的表达，通过免疫组化积分判断两者表达的高低。结果 羊水过少组胎盘滋养细胞Caspase3、Bcl-2表达的免疫组化积分分别为4.90±0.71、1.80±0.76，对照组分别为2.06±0.64、4.00±0.69。羊水过少组Caspase3的表达明显高于对照组(P<0.05)，而Bcl-2则明显低于对照组(P<0.05)。Caspase3与Bcl-2在羊水过少组胎盘滋养细胞中的表达呈负相关(r=-0.74，P<0.05)。结论 胎盘滋养细胞Caspase3高表达、Bcl-2低表达可能与羊水过少的发生有关。Caspase3与Bcl-2在胎盘滋养细胞中的表达失衡可能是羊水过少发生的原因之一。

　　【关键词】 Caspase3;Bcl-2;羊水过少;胎盘;免疫组织化学

　　The expression of Caspase3 and Bcl-2 in placenta and their

　　relationship with oligohydramnios

　　GAO Liping1， SUN Lizhou1*， SUI Canlan2, JIA Zhengwei2, MIAO Yumei2, L Aiyuan2

　　(Department of Obstetrics and Gynecoloy， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing, Jiangsu 210029, China)

　　Abstract: Objective To explore the relationship between the expressions of caspase3 and Bcl-2 in placenta and the event of oligohydramnios. Methods Immunohistochemistry was performed to determine the expressions of caspase3 and Bcl-2 in placenta from a test group (30 cases of oligohydramnios) and a control group (30 cases of normal pregnancy). Results Immunohistochemistry showed the expression of caspase3 in placental trophoblasts was higher in the test group than in the control (4.90±0.71 vs. 2.06±0.64, P<0.05), and the expression of Bcl-2 was lower in the test group (1.80±0.76 vs. 4.00±0.69, P<0.05). The expression of caspase3 was inversely correlated with that of Bcl-2 in oligohydramnios (r=-0.47，P<0.05). Conclusion The expressions of caspase3 and Bcl-2 in placenta may play important roles in oligohydramnios. The imbalance of their expressions may be one of the causes of oligohydramnios.

　　Key words: caspase3;Bcl-2;oligohydramnios;placenta;Immunohistochemistry

　　羊水过少是一种常见的妊娠并发症,其发生会增加围生儿的不良预后和剖宫产率。羊水过少的原因与胎盘功能异常有很大的关系[1]，孕晚期胎盘存在细胞凋亡，而一些凋亡因子(如Caspase3、Bcl-2等)与羊水过少密切相关。本文通过检测羊水正常和羊水过少产妇胎盘组织中Caspase3和Bcl-2的表达情况，探讨两者在羊水过少胎盘滋养细胞中的表达及其相关性。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象 选择2006年7月—2008年6月在我院足月分娩的产妇共60例，其中羊水过少(羊水过少组)30例，正常妊娠(对照组)30例，各组产妇年龄及孕周比较，差异无显著性。各组产妇均为单胎，所有病例均排除内科合并症及其他产科并发症(前置胎盘、胎盘早剥、母儿血型不合、妊娠高血压疾病、胎膜早破、胎儿生长受限等，且排除胎儿畸形)。羊水过少的诊断标准参照《妇产科学》[1]。

　　1.2 标本采集及处理

　　1.2.1 胎盘采集 胎盘娩出后立即在母体面中部剪取组织1块，大小1.5 cm×l.5 cm×1.0 cm。然后用生理盐水漂洗干净，中性甲醛固定24 h，浸蜡，石蜡包埋，4 μm连续切片。

　　1.2.2 Caspase3、Bcl-2免疫组化染色 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)连接法。用二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。实验步骤严格按照操作方法说明进行，空白对照采用磷酸盐缓冲溶液代替一抗。

　　1.3 结果判定标准 采用免疫组化评分(H-score)法[2]。由2名观察者对切片进行盲式阅片，显微镜下随机选择5个高倍镜视野(×400)，观察所选择视野中的所有细胞，记录阳性染色细胞百分数并计分。阴性：小于5%的胎盘合体滋养细胞呈阳性或滋养细胞显色与背景一致，计0分;弱阳性：5%～10% 的胎盘滋养细胞呈阳性，计1分;阳性：11%～50%的胎盘滋养细胞呈阳性，计2分;强阳性：大于50%的胎盘滋养细胞呈阳性，计3分。细胞着色强度则以多数阳性细胞呈现的染色(棕黄色)计分。强着色，计3分;浅着色，计1分;染色强度在浅着色和强着色之间者为中等着色，计2分。将阳性细胞百分数计分和细胞染色计分相加为免疫组化积分。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5 统计软件进行统计分析。实验结果以x±s表示，组间比较采用t检验，采用Spearman分析Caspase3与Bcl-2的相关性。

　　2 结 果

　　2.1 Caspase3、Bcl-2在胎盘组织中的表达定位 Caspase3、Bcl-2主要表达在胎盘滋养细胞和胎盘合体滋养细胞中，羊膜中呈阴性或弱阳性。Caspase3 与Bcl-2蛋白阳性表达呈棕黄色，颗粒状，阳性信号主要定位于胎盘合体滋养细胞的胞质中。见图1。

　　图1 Caspase3、Bcl-2在羊水过少胎盘滋养细胞中的表达

　　A.羊水过少胎盘滋养细胞Caspase3染色阳性(SP，×400);B.羊水过少胎盘滋养细胞Bcl-2染色阴性(SP，×400)

　　2.2 Caspase3、Bcl-2在胎盘组织中的表达比较 羊水过少组胎盘滋养细胞中Caspase3表达水平高于对照组，Bcl-2表达水平低于对照组，差异有显著性(P<0.05)，见表1。表1 胎盘滋养细胞Caspase3、Bcl-2表达的免疫组化积分

　　2.3 Caspase3、Bcl-2在胎盘组织中的表达关系 羊水过少组胎盘滋养细胞中caspase3与Bcl-2的表达水平呈负相关(r=-0.74，P﹤0.05)。

　　3 讨 论

　　3.1 Caspase3、Bcl-2的生物学特性 Caspase是一组半胱天冬蛋白酶家族，其家族成员在细胞凋亡过程中起重要作用。Caspase3是已知的该家族成员中执行细胞凋亡的关键酶之一，它广泛分布于各种类型的细胞中，在细胞内以无活性的前体(酶原)形式存在，被细胞外凋亡信号激活后，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白酶失活，引发细胞凋亡。作为一种效应Caspase，Caspase3是细胞凋亡途径末端底物酶解的关键效应蛋白酶[3]，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也为凋亡的关键酶和执行者，其表达意味着细胞死亡。

　　Bcl-2是抑制细胞凋亡的线粒体膜蛋白，其C末端含有一个19个氨基酸组成的疏水跨膜区，其功能是作为一个信号锚定序列，负责定位和插入到线粒体外膜，抑制细胞凋亡，是迄今研究的最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。Bcl-2可对抗细胞自我产生的氧自由基及细胞外产生的氧自由基(邻近细胞产生)对细胞的毒害与损伤作用，可以抑制或防止多种因素或因子诱发的细胞凋亡，延长细胞的寿命，是许多生理或病理凋亡的关键性调节因子，对细胞凋亡具有直接调节作用。

　　3.2 Caspase3、Bcl-2在羊水过少胎盘滋养细胞中的表达 Caspase3、Bcl-2在细胞凋亡过程中发挥了十分重要的作用，但二者的影响不同。本实验研究中发现，Caspase3、Bcl-2在羊水过少胎盘滋养细胞中的表达呈负相关，即细胞中Caspase3蛋白表达增加，而Bcl-2蛋白表达下降。这种现象的发生可能是由于Bcl-2蛋白可以阻断细胞色素C从线粒体释放，从而抑制Caspase3的激活。Caspase3、Bcl-2蛋白具体是通过怎样的途径来相互影响还有待进一步深入研究。

　　3.3 Caspase3、Bcl-2与羊水过少发生的关系 妊娠是一个复杂的生理过程，正常妊娠胎盘细胞凋亡是一种生理现象，作为组织更新的一种方式一直伴随着胎盘发育全过程。有研究全面观察胎盘中的凋亡细胞，发现50 %以上的凋亡细胞为滋养细胞[4]。滋养细胞的凋亡使细胞体积缩小，滋养细胞表面的水通道蛋白失活，不再介导水分子的跨膜运动，导致细胞对水分子的通透性明显下降[5]，从而引起妊娠羊水过少的发生。

　　正常妊娠胎盘绒毛滋养细胞均有Caspase3的表达，它与细胞凋亡紧密相关，对维持母胎之间的交换及胎儿的发育有着极其重要的意义。凋亡抑制蛋白Bcl-2则在抑制滋养细胞凋亡中起保护作用，近期研究证实低表达Bcl-2可致滋养细胞凋亡降低[6]。Caspase3和Bcl-2在子宫与胎盘界面的表达异常可导致母胎间营养物质交换发生紊乱，出现水通道异常，胎盘发生病理改变及继发性影响胎儿的生存环境羊水的变化，从而导致病理妊娠的发生。本研究发现光镜下Caspase3在羊水过少组胎盘滋养细胞的表达以中度及强阳性为主，明显高于正常妊娠组，差异有显著性(P<0.05)，羊水过少组胎盘滋养细胞Bcl-2的表达明显低于正常妊娠组(P<0.05)。我们推测：羊水过少患者胎盘滋养细胞高表达Caspase3和低表达Bcl-2可能在诱导滋养细胞自身凋亡中起协同作用，两者共同促进滋养细胞自身凋亡增加，影响叶状绒毛膜的结构和功能，导致滋养细胞浸润蜕膜的能力下降，胎盘血管网形成不良，导致物质交换障碍，影响水循环及其调节，从而使母体、胎儿及胎盘之间的物质交换及水的运动降低，参与羊水过少的发生。

　　羊水过少的病因及发病机制尚未明确，Caspase3及Bcl-2蛋白在羊水过少的胎盘组织中的异常表达，对羊水过少的诊断及治疗提供了重要参考价值，确切机制有待于进一步研究。我们期望通过扩大样本量，进行多变量分析和研究，寻找羊水过少发生的生物学特性,从而揭示其发生、发展的规律,为羊水过少的预防、早期诊断和有效治疗提供新的研究思路和方法。

　　【参考文献】

　　[1] 乐 杰.妇产科学[M].第6版.北京：人民卫生出版社，2004：135-137.

　　[2] Ota H ， Igarashi S， Sasaki M, et al. Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and endometrium in endometriosis and adenomyosis [J].Hum Reprod，2001，16(3)：561-566.

　　[3] 尹 伶，濮德敏，韦立蓓,等. Caspase3在NS-398诱导宫颈癌Hela细胞凋亡中的作用[J].中国肿瘤临床,2007,34(12):711-713.

　　[4] Ishihara N， Matsuo H， Murakoshi H, et al. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsia or intrauterine growth retardation [J].Am J Obstet Gyneco1，2002，186(1)：158-166.

　　[5] 鞠晓静,朱振龙, 魏守礼. 水通道蛋白对凋亡的影响[J].河北医科大学学报, 2008，29(1):118-120.

　　[6] Ratts VS， Tao XJ， Webster CB，et al.Expression of BCL-2, BAX and BAK in the trophoblast layer of the term human placenta: a unique model of apoptosis within a syncytium [J].Placenta，2000，21(4)：361-366.