肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在顺铂作用下的卵巢癌细胞中表达的变化

　　作者：韩秋峪，陆晓媛，闫洪超 作者单位：(徐州医学院附属医院妇产科，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 研究顺铂(cDDP)作用下人卵巢上皮性癌细胞株3AO中肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82的表达的变化，初步探讨其作用机制。方法 采用倒置显微镜观察cDDP作用后3AO细胞形态学的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察cDDP对细胞增殖的影响;运用免疫细胞化学方法检测不同浓度cDDP(1、3、9 mg/L 3个浓度组)作用的3AO细胞株中KAI1/CD82表达情况,并与细胞对照组(未经药物处理)进行比较。结果 cDDP作用后细胞体积缩小、细胞内颗粒增多，细胞核固缩、深染，细胞凋亡;cDDP对3AO细胞的生长抑制作用呈明显的剂量依赖关系;cDDP作用后卵巢癌细胞中KAI1/CD82基因的表达较对照组明显增强。结论 cDDP不仅能增加对卵巢癌细胞的生长抑制率，而且能上调卵巢癌细胞中肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82的表达，为临床上药物抑制肿瘤转移的深入研究提供了有利的实验依据。

　　【关键词】 卵巢肿瘤;肿瘤转移抑制基因;KAI1/CD82;卵巢上皮性癌细胞3AO;顺铂

　　The variation of the expression of tumor metastasis suppressor gene KAI1/CD82

　　in human ovarian cancer cell line 3AO treated with cisplatin

　　HAN Qiuyu， LU Xiaoyuan， YAN Hongchao

　　(Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College， Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract： Objective To investigate the effect of cisplatin (cDDP) on variations of the expression of metastasis suppressor gene KAI1/CD82 in human ovarian epithelial cancer cell line 3AO and to make a preliminary study of the mechanism of cDDP. Methods Following cDDP administration, the 3AO cells was visualized morphologically by inverted microscopy. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was employed to observe the effects on cellular proliferation. A wide range of cDDP concentrations (1 mg/L, 3mg/L and 9 mg/L) were used to detect the expression levels of KAI1 gene in 3AO cell lines by immunocytochemistry (ICH) and to make comparisons with the control group (untreated with the drug). Results Treated with all concentrations of cDDP, 3AO cells shrinked, cellular granule number increased, resulting in nuclear pycnosis, deep-staining and cell apoptosis. MTT assay demonstrated that cDDP could partially inhibit the growth of 3AO cells, with a marked dose-dependent tendency. The KAI1/CD82 protein expression in different 3AO cells treated with cDDP was significantly up-regulated compared with the control (P<0.05). Conclusion Not only does cDDP have a significant inhibitory effect on the growth of human ovarian cancer cell line， but also could effectively up-regulate KAI1/CD82 expression in human ovarian cancer cell line, which provides beneficial experimental evidence for clinical chemotherapy for tumor metastasis.

　　Key words： ovarian neoplasms; tumor metastasis suppressor gene; KAI1/CD82; ovarian cancer cell line 3AO; cisplatin

　　卵巢上皮性癌在所有的妇科恶性肿瘤中具有较高的病死率，其5年生存率始终徘徊在30%左右，而局部浸润和转移则是导致患者死亡的主要原因。我们在研究中发现肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在卵巢上皮性癌中的表达与肿瘤的临床分期、肿瘤分化、转移、癌性腹水密切相关，并且KAI1/CD82基因表达下调是肿瘤发生侵袭转移的危险因素之一[1]。因此，在此基础上，我们期望通过分析能够激活KAI1基因表达的特异性抗肿瘤药物，为临床上药物治疗肿瘤转移提供理论依据。顺铂(cisplatin，cDDP)自从问世以来已成为卵巢癌化疗的核心药物，其化疗效果广泛得到公认，但对其在抑制肿瘤转移方面的研究目前尚鲜见报道。本研究通过观察cDDP对卵巢上皮性癌细胞株3AO中肿瘤转移抑制基因KAI1表达的影响，进而对KAI1基因的激活途径、作用机制作初步探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株 人卵巢黏液性囊腺癌细胞株3AO购自ATCC (The American Type Culture Collection)，由徐州医学院附属医院中心实验室冻存。细胞复苏后培养于含10%新生小牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、5% CO2培养箱中培养并传代。

　　1.1.2 试剂 RPMI-1640细胞培养基为Gibco BRL公司产品。二甲基亚砜(DMSO)及四甲基偶氮唑蓝(MTT)为Sigma公司产品。新生小牛血清为杭州四季青公司产品，使用前经56℃灭活30 min，置于-20℃冰箱内保存备用。cDDP注射液为贵州汉方制药有限公司产品，相对分子质量为300.05，剂型规格为每50 ml注射液含50 mg cDDP及450 mg氯化钠;鼠抗人KAI1/CD82单克隆抗体为NeoMarkers公司产品，购于深圳晶美生物工程有限公司。SP免疫组织化学试剂盒购于福建迈新生物工程有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞的药物处理 将cDDP注射液用生理盐水溶解成0.05 g/L的储存液，-20℃避光保存。根据临床化疗使用cDDP的血药浓度，处理细胞的cDDP浓度梯度分别为1 mg/L、3 mg/L、9 mg/L。

　　1.2.2 倒置显微镜下观察不同浓度cDDP作用后细胞形态变化 取对数生长期的3AO细胞常规传代培养于25 cm2培养瓶中，2～3天换液1次，待长至60%融合时，分别加入含上述3种浓度药物的RPMI-1640小牛血清培养液5 ml，对照组为不含药物的小牛血清培养液，37℃、5% CO2条件下继续孵育24～48 h，吉姆萨染色固定细胞，倒置显微镜下观察细胞形态并记录。

　　1.2.3 MTT法检测cDDP对细胞的生长抑制作用 细胞对照组：取对数生长期的3AO细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×107/L，以每孔100 μl接种于96孔培养板中，加培养液使每孔体积200 μl;cDDP组：将上述的单细胞悬液100 μl接种于96孔培养板中，另外加各不同浓度药物至200 μl;空白对照组：与实验孔平行设不加细胞只加培养液200 μl的空白对照孔，比色时以空白孔调零。将细胞移入CO2培养箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，培养24～72 h。培养终止前，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl，37℃，继续孵育4 h，终止弃上清。每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值(D值)。实验设4个平行样本，6个复孔，结果取平均值。细胞存活率=(细胞实验组D值/细胞对照组D值)×100%;细胞抑制率=1-细胞存活率。

　　1.2.4 免疫细胞化学染色观察cDDP作用下KAI1基因表达的情况 在6孔细胞培养板内平铺经多聚赖氨酸(PLL)处理过的无菌盖玻片。取单细胞悬液(细胞浓度为108/L)1 ml接种于盖玻片上，对照组加入1 ml含15%新生小牛血清的培养液，cDDP组加入各不同浓度cDDP 100 μl后，用培养液补充至2 ml。将培养板置37℃、5% CO2条件下孵育24 h，取出玻片，冷丙酮固定20 min，按SP试剂盒进行免疫细胞化学染色，抗体工作浓度为1∶50。运用IPP 4.1统计软件对免疫细胞化学图像进行灰度测量，由测试区的灰度级(GA)和面积(m+n)及阳性反应区的灰度级(Ga)和面积(n)，即可求得阳性单位(PU)。

　　测算公式为：PU=100×∣Ga-GA∣/(AAβ.Gmax)。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS 10.0统计软件包进行统计学分析。组间均数的比较采用单因素方差分析和两两比较的q检验。组间细胞抑制率的比较采用方差分析。以P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 cDDP作用后卵巢癌3AO细胞株形态观察 细胞经各不同浓度的cDDP处理24 h后均可见部分细胞变圆，细胞间隙增大，细胞内颗粒增多。培养48 h大多数细胞细胞体积缩小，核固缩、深染，部分细胞崩解形成凋亡小体(apoptotic body)。上述改变呈明显的剂量依赖性。

　　2.2 不同剂量cDDP对卵巢癌3AO细胞增殖抑制率的影响 结果表明，cDDP组的细胞抑制率除1 mg/L组与细胞对照组差异无显著性(P>0.05)外，其余各浓度组的细胞抑制率均明显高于细胞对照组(P<0.05);cDDP组各组间的细胞抑制率随着药物浓度的增加而增加，呈现明显的剂量依赖性，两两比较差异亦有显著性(P<0.05)。见表1。

　　2.3 cDDP对卵巢癌3AO细胞中KAI1/CD82表达的影响 免疫细胞化学SP法染色显示细胞对照组3AO细胞的胞膜上出现散在分布的淡棕黄色细颗粒，细胞边界着色不连续(图1)。而各cDDP各浓度组均可见明显的的KAI1/CD82蛋白阳性表达，呈不同程度的棕黄色粗颗粒分布于细胞膜上或散在于细胞质中，细胞轮廓清晰，边界连续。即使细胞的凋亡小体中亦表现为KAI1/CD82蛋白的强表达(图2～4)。免疫细胞化学图像分析结果见表2，统计分析表明各cDDP各浓度组与细胞对照组相比，KAI1基因的表达明显增强(P<0.05)。表1 不同剂量cDDP对人卵巢癌3AO细胞的生长抑制作用 表2 cDDP对卵巢癌3AO细胞中KAI1表达影响的图像分析

　　3 讨 论

　　KAI1基因最初是以前列腺癌转移抑制基因而被认识的。研究表明，KAI1/CD82蛋白对肿瘤转移的抑制作用主要源于该基因对肿瘤细胞运动、侵袭和转移的影响，这主要与其调节细胞的黏附功能有关。KAI1/CD82蛋白主要存在于白细胞和组织细胞表面，属于跨膜4超家族(TM4SF)成员。其分子结构的共同特点是有4个疏水跨膜区和一个大的包括3个潜在氨基末端糖基化位点在内的细胞外亲水区，通过介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的黏附，在肿瘤细胞的浸润和转移中发挥着重要的作用。国内有学者利用脂质体介导KAI1 cDNA转染高转移性人卵巢癌细胞株HO-8910PM后发现，转染后的癌细胞黏附率明显下降，穿透人工基底膜的能力也显著降低[2]，也有力地证实了这一点。进一步的临床研究发现，KAI1基因不仅随着肿瘤的临床进展在组织中的表达逐渐缺失，而且与卵巢上皮性癌患者的预后密切相关[3]。我们推测这可能与KAI1基因抑制肿瘤的转移有关，该基因的作用可以限制肿瘤向浸润转移阶段的发展。由此可见，激活肿瘤转移抑制基因KAI1的表达对于有效地控制肿瘤的扩散、转移和复发，延长荷瘤机体的生存期，改善肿瘤患者的预后具有重要的临床意义。

　　cDDP为铂的金属络合物。作为一种细胞周期非特异性药物，它可以选择性地攻击DNA碱基的氮原子，特别是鸟嘌呤的第7位氮原子，它也可与胞嘧啶的第3位氮原子结合。由于和DNA呈交叉联结，cDDP对DNA的构型有明显影响，可使双螺旋解旋，DNA分子变短或断裂。不仅如此，cDDP还可以通过使DNA模板作用的失活，抑制DNA的合成。

　　目前在诱导卵巢上皮性癌细胞凋亡、抑制癌性腹腔积液的形成以及控制腹腔积液的增长等方面，cDDP的作用已经达到国内外学者的广泛共识。但是，有关cDDP参与抑制肿瘤转移的研究，尤其是与肿瘤转移抑制基因的关系，报道甚少。Houle等[4]通过建立裸鼠卵巢癌腹腔播散模型，用cDDP协同γ射线照射进行研究发现，低剂量cDDP(为裸鼠用药量)单独或联合γ射线可部分抑制卵巢癌的腹腔播散，而高剂量cDDP联合γ射线则可完全抑制肿瘤播散。作者认为cDDP联合γ射线有协同抑制卵巢癌播散的作用。同时，该研究还观察到经cDDP处理后的卵巢癌细胞中，CD44含量有所增加。黏附分子CD44是CD44基因指导编码合成的跨膜蛋白。它可作为透明质酸的受体，与其结合并"锚定"在宿主细胞外间质和基底膜上，从而抑制肿瘤细胞脱落和新生血管发生，进而抑制癌细胞的浸润和转移，这与KAI1基因抑制肿瘤转移的机制不谋而合。然而CD44基因表达水平的上调是否为cDDP的作用效应，cDDP上调CD44表达的机制又是如何，这些都有待进一步研究。此外，还有学者在实验中观察到cDDP能增强卵巢癌细胞中MHC基因的表达。MHC基因是一组编码细胞表面蛋白分子或抗原的基因，其抑制肿瘤转移主要是增强肿瘤细胞的肿瘤抗原和MHC-Ⅰ类抗原，而转移性癌细胞则不表达MHC-Ⅰ类抗原，由此导致癌细胞免疫原性降低，不能有效地将肿瘤抗原递呈给T细胞，逃避细胞杀伤而发生转移[5]。

　　我们在实验中观察到，cDDP对卵巢癌3AO细胞的生长具有明显的抑制作用，高剂量组(9 mg/L)可见明显的细胞肿胀、细胞核染色质模糊不清，呈均质状，核固缩或破碎，出现典型的凋亡小体，这种变化与国内外的文献报道是一致的。更重要的是，我们通过免疫细胞化学染色观察到cDDP的各不同剂量组均能诱导KAI1/CD82蛋白的表达，与未经cDDP处理的细胞对照组相比，KAI1/CD82蛋白的表达明显增强。而且其表达水平呈明显的剂量依赖性，高浓度组的表达明显强于低浓度组。我们推测cDDP对KAI1基因表达的激活作用是一个极其复杂的多途径的过程，涉及到多种基因的参与、调控及信号传导。目前已有报道认为在肿瘤转移抑制基因的激活过程中，cDDP对野生型p53基因和bax基因的上调应该起着举足轻重的作用[6]，其中是否还同时存在着其他黏附分子的协同作用以及cDDP是发挥了直接作用还是间接作用，仍将是我们今后研究的重点。

　　【参考文献】

　　[1] 韩秋峪，张向宁，李小翠，等.KAI1/CD82和E-Cadherin蛋白在卵巢上皮性癌中表达的临床意义[J].山东大学学报(医学版)，2006，44(7)：729-733.

　　[2] 宋 晖，辛晓燕，肖 锋，等.肿瘤转移抑制基因KAI1对卵巢癌细胞增殖及侵袭力的影响[J].现代妇产科进展，2003，12(5)：348-350.

　　[3] Schindl M, Birner P, Breitenecker G, et al. Downregulation of KAI1 metastasis suppressor protein is associated with a dismal prognosis in epithelial ovarian cancer [J]. Gynecol Oncol，2001，83(2)：244-248.

　　[4] Houle CD, Ding XY, Foley JF, et al. Loss of expression and altered localization of KAI1 and CD9 protein are associated with epithelial ovarian cancer progression [J]. Gynecol Oncol，2002，86(1)：69-78.

　　[5] 黄光琦，贺国丽，宋 毅，等.几种肿瘤转移基因变化与卵巢癌转移的相关性[J].华西医科大学学报，2002，33(1)：28-31.

　　[6] Liebermann DA, Haffman B, Steinman RA, et al. Molecular controls of growth arrest and apoptosis, p53-dependent and independent pathways [J]. Oncogene，1998，11(7)：199-209.