GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建

　　作者：李奇灵，王英，王运萍，冯彩霞，高尚风 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法 将T-h GM-CSF重组质粒转化入感受态大肠杆菌中,筛选出耐药性单克隆菌落送测序。利用PCR技术扩增出GM-CSF目的基因片段，将PCR产物连入pGEM-T easy载体，转化入大肠杆菌中扩增，用SDS碱裂解法提取Teasy-GM-CSF重组质粒，用限制性内切酶酶切Teasy-GM-CSF重组载体，连入经相同酶酶切的pLXSN反转录病毒载体中。用磷酸钙沉淀法转染PA317包装细胞系进行病毒包装，用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19细胞，经G418加压筛选感染成功的NuTu-19/GM-CSF细胞，用免疫细胞化学和ELISA法检测NuTu-19/GM-CSF分泌表达GM-CSF蛋白的情况。结果 T-h GM-CSF重组质粒测序结果与GenBank Accession#：NM_000758基因序列对比后确定为人类GM-CSF基因编码序列;PCR产物酶切电泳在Mark 400-500 bp中有一条带，符合GM-CSF基因序列长度;重组Teasy-GM-CSF质粒用EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切后，电泳鉴定在400-500 bp之间有一目的条带，重组反转录病毒质粒pLGM-CSFSN酶切电泳有目的条带;G418加压筛选感染后的NuTu-19细胞，14 d后慢慢形成单克隆继续生长;免疫细胞化学检测到感染成功的NuTu-19细胞膜表面有明显的棕褐色颗粒沉淀，ELISA法检测细胞培养上清液中GM-CSF的质量浓度为150 pg/mL。结论 成功构建了能分泌表达人GM-CSF蛋白的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF，为以后研究卵巢癌免疫治疗提供必备、有效、可靠的工具基础。

　　【关键词】 NuTu-19细胞 粒细胞单核细胞集落刺激因子 卵巢肿瘤 免疫治疗

　　Construction of ovarian cancer cell NuTu-19/GM-CSFgenetically modified by GM-CSF

　　Li Qiling, Wang Ying, Wang Yunping, Feng Caixia, Gao Shangfeng

　　(Department of Gynecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To construct NuTu-19/GM-CSF ovarian cancer cells which can secrete and express granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Methods The T-h GM-CSF recombinant plasmid was transformed into competent Top109 Bacillus colis and the positive colonies were cultivated in soft agar medium. The T-h GM-CSF recombinant plasmid was used as models to amplify GM-CSF gene fragment by PCR. The certain fragment was linked with the pGEM-T easy vector and transformed into Top109 bacillus coil. SDS alkaline lysis was used to get T easy-GM-CSF recombinant plasmid with pLXSN retrovirus vector cut by the same enzymes. The pseudotype virus was packed after transfecting PA317 cells using calcium phosphate precipitation. The supernate fluid which contained virus to infect NuTu-19 cells was saved. The positive cells were harvested through pressurizing selected by G418. The GM-CSF protein secreted by NuTu-19/GM-CSF cells was tested by immunocytochemistry and ELISA. Results T-h-GM-CSF included the human GM-CSF gene fragment which contained 435 bp and signal peptide coding region, compared with the sequence of Genebank Accession#: NM-000758. Production of PCR was between 400 bp and 500 bp in the agarose electrophoresis, and had the same length with hGM-CSF gene. There was an electrophoretic strap between 400 bp and 500 bp and the sequence of the cutting fragment was completely correct after cutting T easy-GM-CSF recombinant plasmid by EcoRⅠ and BamHⅠ enzymes. It showed that the amplification of　the GM-CSF gene fragment and the connection with T easy vector were successful. There was still the same strap between 400 bp and 500 bp in the agarose electrophoresis of pLGM-CSFSN after being cut by EcoRⅠ and BamHⅠ enzymes. The infected NuTu-19/GM-CSF cells cultivated in medium containing G418 continued to grow in the forms of monoclone 14 days later. There were some visible granules on the surface of the cellular membrane. The amount of GM-CSF in suspent liquid of cells culture was 150 pg/mL tested by ELISA. Conclusion The construction of NuTu-19/GM-CSF which can secret and express GM-CSF protein is successful, and offers effective and necessary basis for future study on ovarian cancer immunotherapy.

　　KEY WORDS: NuTu-19 cell; granulocyte-macrophage colony-stimalating factor (GM-CSF); ovarian cancer; immunotherapy

　　卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其主要特点是隐蔽性高，临床不易被发现，易发生转移。近20年来国际妇产联盟(FIGO)提出Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌患者5年生存率一直徘徊在15%-30%，病死率高居妇科肿瘤首位，其根本原因在于肿瘤的复发和转移。在过去的20多年内，免疫治疗是继手术、放疗、化疗外的又一大肿瘤辅助疗法。我们利用分子生物学技术构建了能分泌表达人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白的大鼠卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF，为其用于卵巢癌免疫治疗研究打好基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　原发性大鼠卵巢上皮性腺癌NuTu-19细胞由原华西医科大学王和教授惠赠本室保存。T-h GM-CSF重组质粒由中国医学科学院中国协和医科大学基础医学院陈松森教授馈赠。TOP109细菌由西安华广生物有限公司提供，由本室保存，包装细胞系PA317细胞、反转录病毒载体pLXSN购于美国Colontech公司，pGEM-T easy载体购于美国Promega公司。

　　1.2 试剂

　　Taq DNA聚合酶及dNTPs、T4 DNA连接酶均为立陶宛Fermentas MBI公司。RPMI1640培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清为杭州四季青公司产品，EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶购于华美生物有限公司，兔抗人GM-CSF多克隆抗体为武汉博士德公司产品，山羊抗兔二抗为美国Jacksonimmuno公司产品，ELISA检测试剂盒购于北京中昊时代生物技术中心。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 含有目的片段的反转录病毒载体的构造

　　将T-h GM-CSF重组载体转入感受态TOP109大肠杆菌中，在Amp+琼脂培养基中筛选出抗药性单克隆，扩增、测序鉴定后，以此载体为模板设计引物，采用PCR方法扩增出GM-CSF编码区。引物为：正向引物F链为5′-CGAATTCATGTGGCTGCAGAGCCAGC;反向引物R链为5′-CGGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC，并分别引进EcoRⅠ酶BamHⅠ酶切位点。PCR扩增产物连入pGEM-Teasy载体中，用相同方法筛选出单克隆扩增后再次酶切电泳送测序鉴定。鉴定正确后用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切Teasy-GM-CSF重组质粒，切出GM-CSF目的基因连入经相同酶酶切后的反转录病毒载体pLXSN中，酶切电泳鉴定后大量扩增，制备重组反转录病毒载体pLGM-CSFSN重组质粒。

　　1.3.2 细胞培养及条件

　　PA317细胞、NuTu-19细胞均用含100 mL/L胎牛血清RPMI 1640培养基于37 ℃ 50 mL/L CO2饱和湿度培养箱内培养。

　　1.3.3 磷酸钙沉淀法包装病毒

　　PA317细胞传代，在PA317细胞80%成片时弃上清液后加入新鲜培养液5 mL，后缓慢加入转染液500 μL，轻轻混匀后置37 ℃ 50 mL/L CO2饱和湿度培养箱内培养，显微镜下观察细胞立体结构变模糊，胞膜胞内可见细小颗粒时换液为100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液，3 d后收病毒液。

　　1.3.4 G418最佳药物浓度的选择

　　取6孔板加入未经转染的NuTu-19细胞悬液(约1 000 cell/mL)，培养6 h后依次分别加入含有G418的培养液,质量浓度分别为50、100、200、400、600、800 μg/mL培养液培养细胞，3-5 d换液1次，14 d后确定最佳筛选浓度。

　　1.3.5 制备GM-CSF修饰的NuTu-19/GM-CSF细胞

　　选对数生长期贴壁良好的NuTu-19细胞进行病毒转染。细胞内加入5 mL含10 g/L polybrene病毒液轻轻混匀后，置37 ℃ 50 mL/L CO2饱和湿度培养箱内培养，6 h后换液，反复转染5次后换液培养。后加入G418 100 μg/μL，长满培养瓶壁后撤去G418。

　　1.3.6 免疫细胞化学方法检测NuTu-19/GM-CSF细胞分泌表达GM-CSF蛋白

　　分2组：A组为未转染的NuTu-19细胞，B组为转染的NuTu-19/GM-CSF细胞，丙酮固定30 min，7.5 mL/L H2O2-PBS液37 ℃孵育30 min后用PBS清洗。50 mL/L TritonX-100 37 ℃下孵育30 min后再次PBS洗3遍，滴加山羊血清，室温下孵育20 min后倾去残留血清，滴加1∶200稀释后的大鼠抗人GM-CSF一抗，37 ℃下置湿盒内60 min后用PBS轻轻冲洗3次。滴加抗兔二抗(1∶1 000稀释)室温下孵育2 h后，滴加新鲜配制的0.6 g/L DAB显色液，室温下湿盒内放置20 min后，用自来水洗5 min后显微镜下摄片。

　　1.3.7 ELISA法检测NuTu-19/GM-CSF细胞分泌表达GM-CSF蛋白

　　设标准孔8个，以未进行质粒转染的细胞上清液作为空白对照，以反转录病毒载体pLXSN转染组细胞的培养上清液为阴性对照，每个样本做3个复孔，测定细胞转染上清液中GM-CSF蛋白表达水平。结果用Bio-Rad Model680 Microplatereader于波长490 nm处测定吸光度(A)值表示，结果以实验组/阴性对照组≥2.1判为阳性。

　　2 结果

　　2.1 含有目的片段的反转录病毒载体的构造

　　T-h GM-CSF重组质粒送测序结果与GenBank Accession#：NM-000758基因序列对比后确定为人类GM-CSF基因编码序列，从ATG-TGA共435个碱基对，含有信号肽编码区。T-h GM-CSF质粒序列正确。PCR扩增出目的片段经透析膜回收法回收，10 g/L琼脂糖电泳后可见一条带在400 bp-500 bp之间(图1);后连入T-easy载体中用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，鉴定结果有目的片段切出(图2)，遂再次送测序，经软件分析PCR扩增产物为GM-CSF目的片段，且成功连入T-easy载体中。用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切出目的片段连入经相同酶切的pLXSN反转录载体扩增后酶切鉴定，可见目的片段切出(图3)。

　　2.2 转染结果

　　PA317细胞转染后第2天细胞部分死亡，3 d后收病毒上清液保存于-20 ℃冰箱内。

　　2.3 G418最佳药物浓度的选择

　　G418浓度筛选第8天时50、100 μg/μL培养孔内部分细胞死亡，200 μg/μL及以上孔内大部分细胞死亡，14 d后100 μg/μL孔内细胞全部死亡，50 μg/μL孔内细胞尚有一部分细胞贴壁存活，其余孔14 d前全部死亡，遂选100 μg/μL质量浓度为G418筛选抗性NuTu-19/GM-CSF细胞的筛选浓度。

　　2.4 制备GM-CSF修饰的NuTu-19/GM-CSF细胞

　　NuTu-19细胞重复病毒感染培养3 d后传代并加入G418加压筛选，14 d后绝大部分细胞死亡，瓶内形成单克隆细胞集落，后细胞集落开始生长成片，25 d后撤去G418，继续培养细胞至贴满瓶壁。

　　2.5 免疫细胞化学结果

　　转染的NuTu-19细胞胞膜表面有深棕褐色着色，与未转染的NuTu-19细胞形成鲜明对比，胞质内较少见明显褐色颗粒沉淀(图4、图5)。

　　2.6 NuTu-19/GM-CSF细胞分泌表达GM-CSF蛋白检测结果

　　pLGM-CSFSN转染的NuTu-19细胞的培养上清ELISA检测GM-CSF，其A值为1.267±0.07;空质粒pLXSN转染的NuTu-19细胞培养上清其A值为0.32±0.02，实验组/阴性对照组>2.1，表明pLGM-CSFSN转染细胞后能够表达GM-CSF，质量浓度约为150 pg/mL。

　　3 讨 论

　　随着肿瘤免疫学的不断深入发展，肿瘤免疫治疗也随之发展并逐步成为人们研究治疗肿瘤的新热点。目前肿瘤免疫治疗主要包括多肽类疫苗、基因疫苗、树突状细胞疫苗和肿瘤全细胞疫苗，其中肿瘤全细胞疫苗可以将所有可能与肿瘤相关的抗原加工提呈给抗原提呈细胞(APC)，从而激起体内有效的抗肿瘤免疫反应。考虑到肿瘤细胞的弱抗原性，许多研究者结合免疫佐剂、细胞因子或者与树突状细胞融合制备疫苗，使机体能将更多的肿瘤抗原提呈给T淋巴细胞，激起体内更强的抗肿瘤效应。

　　GM-CSF不仅促进骨髓造血细胞系的存活、生长、分化,而且还能促进成熟的巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞的存活、生长、分化及功能活化[1]。它是由T细胞、单核细胞、上皮细胞和纤维细胞等多种细胞在受到免疫刺激时分泌的。尽管分泌具有局限性，但能通过旁分泌的作用来招募中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞来增强宿主的防御能力[2]。GM-CSF还可以通过活化Jak/STAT信号途径抑制早期多核嗜中性淋巴细胞的自发性凋亡[3]。目前世界公认用GM-CSF生物制剂用于治疗化疗后白细胞减少是有效的，并广泛应用于临床。在肿瘤免疫治疗的研究中，Dinc等[4]用二甲肼在大鼠体内造结肠癌肿瘤模型中研究发现GM-CSF能降低肿瘤的发生率。Dranoff等[5]比较TNF、GM-CSF等10种细胞因子基因的抗肿瘤作用，发现反转录病毒介导的GM-CSF最有潜力，它能引起持久的特异性抗肿瘤效应。此后GM-CSF被广泛应用于肿瘤治疗的研究中。

　　GM-CSF做为抗肿瘤免疫治疗佐剂的研究已相当成熟，并部分应用于临床研究中。日本于1998年进行转GM-CSF基因的自体肾癌细胞瘤苗对晚期患者行在体免疫治疗的第一期临床研究，受试对象为第IV期肾癌肿瘤患者伴肺转移，结果表明基因修饰的瘤苗治疗在体实验无明显的毒副作用，不仅有抑制肿瘤恶化进展的趋势，且在肿瘤组织病检中发现肿瘤组织中有大量的淋巴细胞浸润，以CD8+细胞为主[6]。此外在前列腺癌、黑色素瘤中的治疗研究中也得到相同的效应。无论动物实验或者临床实验均未见到GM-CSF修饰的瘤苗在治疗研究中会引起严重的不良反应，其大部分不良反应只包括头疼、发热、局部注射部位红肿发热等[7]。近期研究表明GM-CSF在正常卵巢组织中亦有少量表达，大部分由黄体组织合成分泌的，尽管GM-CSF不是卵巢生长所必需的，但它不仅对从卵泡期到黄体期转变过程起重要作用，而且还可以通过活化黄体期卵巢组织中的巨噬细胞来调节体内类固醇激素的生成[8]。国内外对GM-CSF是否促进卵巢肿瘤细胞增殖也进行了许多研究，目前研究结果不支持GM-CSF有促进卵巢肿瘤细胞增殖的作用[9]。所以，GM-CSF是一种比较理想也比较成熟的免疫佐剂，安全有效且其本身具有一定的抗肿瘤效应。

　　本实验是利用分子生物学方法构建含有人GM-CSF基因的重组反转录载体pLGM-CSFSN，经包装细胞PA317包装病毒后感染NuTu-19细胞，经G418加压筛选后获得感染成功的NuTu-19/GM-CSF细胞，并从形态学方面检测与未感染的NuTu-19细胞相比，感染后的NuTu-19/GM-CSF细胞分泌表达GM-CSF蛋白量明显增多，且成功分泌表达到胞外，其分泌量约为150 pg/mL。免疫细胞化学结果发现转染的NuTu-19细胞胞膜表面有深棕褐色着色，与未转染的NuTu-19细胞形成鲜明对比。胞质内较少见明显褐色颗粒沉淀可能一方面是GM-CSF本身携有信号肽,是一种分泌性蛋白，合成之后在信号肽引导下穿胞膜分泌到细胞外上清液中，另一方面由于G418加压筛选本身对细胞来说是一种损伤。

　　总之，本实验将GM-CSF基因整合修饰卵巢癌细胞，使其稳定表达GM-CSF蛋白，为下一步动物实验进行免疫治疗研究奠定安全、可靠、有效的基础。

　　【参考文献】

　　[1]Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor [J]. J Exp Med, 1992, 176(6):1693-1702.

　　[2]Shi Y, Liu CH, Robert AI, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and dont know [J]. Cell Res, 2006, 16(2):126-133.

　　[3]Fortin CF, Larbi A, Dupuis G, et al. GM-CSF activates the Jak/STAT pathway to rescue polymorphonuclear neutrophils from spontaneous apoptosis in young but not elderly individuals [J]. Biogerontology, 2007, 8(2):173-187.

　　[4]Dinc S, Ozbirecikli B, Kuru B, et al. Long term administration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor decreases development of 1-2 dimethylhydrazine-induced colon cancer in rats [J]. J Surg Oncol, 2007, 95(1):12-21.

　　[5]Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(8):3539-3543.

　　[6]Kawai K, Tani K, Yamashita N, et al. Advanced renal cell carcinoma treated with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene therapy: a clinical course of the first Japanese experience [J]. Int J Urol, 2002, 9(8):462-466.

　　[7]Offringa R, Van derBurg SH, Ossendorp F, et al. Design and evaluation of antigen-specific vaccination strategies against cancer [J]. Curr Opin Immunol, 2000, 12(5):576-582.

　　[8]Jasper MJ, Robertson SA, Van der Hoek, et al. Characterization of ovarian function in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-deficient mice [J]. Biol Reprod, 2000, 62 (3):704-713.

　　[9]Herzog TJ, Horiuchi TK, Williams S, et al. Growth modulatory effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on human cell lines derived from gynecologic malignancies [J]. Am J Obstet Gynecol, 1996, 174(1 Pt 1):161-168.