凋亡调控因子Survivin和Caspase
发表时间：2010-06-10 浏览次数：379次
作者：范引侠，薛翔，主改侠 (西安交通大学医学院第二附属医院妇产科，陕西西安 710004)
摘要：目的 探讨凋亡调控因子Survivin和Caspase3在子宫内膜癌发生发展中的作用及二者之间的关系。方法 采用免疫组化SP法对13例正常子宫内膜、28例增生性子宫内膜及50例子宫内膜癌中Survivin和Caspase3表达进行了研究。结果 ①正常子宫内膜、增生性子宫内膜、子宫内膜癌中Survivin蛋白表达阳性率分别为61.5%、85.7%、86.0%，三组间无显著性差异(P>0.05)。其过表达(-)阳性率分别为7.6%、14.3%、40.0%，子宫内膜癌与正常子宫内膜及增生性子宫内膜间均有显著性差异(P<0.05)。随着子宫内膜腺癌组织学分级的升高，Survivin过表达阳性率增加，G3、G2与G1间均有显著性差异(P<0.05)。②正常子宫内膜、增生性子宫内膜、子宫内膜癌中Caspase3蛋白表达阳性率均为100%，各组间无显著性差异(P>0.05)。其过表达阳性率分别为92.3%、92.8%、60.0%，子宫内膜癌与正常子宫内膜及增生性子宫内膜间有显著性差异(P<0.05)，在子宫内膜腺癌组织学分级G1、G2、G3中，Caspase3过表达率呈下降趋势，但三组间无显著性差异(P>0.05)。③子宫内膜癌中Survivin过表达与Caspase3表达呈负相关(rs=0.287, P<0.05)。结论 子宫内膜癌中Survivin过表达增加，Caspase3表达下降，机体抑制凋亡能力增强，促凋亡功能减退，打破了细胞增殖与凋亡之间的平衡，在子宫内膜癌发生中可能起一定作用，也可能与子宫内膜癌的恶性生物学行为有关。
关键词：子宫内膜癌;Survivin;Caspase3
The expression and significance of apoptosis modulator Survivin and Caspase3 in endometrial carcinoma
Fan Yinxia, Xue Xiang, Zhu Gaixia
(Department of Gynaecology & Obstetrics, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the functions of apoptosis modulator Survivin and Caspase3 in developing endometrial carcinoma and the relationship among them. Methods We studied the expression of Survivin and Caspase3 in 13 cases of normal endometrium, 28 cases of proliferative endometrium, and 50 cases of endometrial carcinoma with immunohistochemical SP methods. Results ① The positive rate of Survivin in normal endometrium, proliferative endometrium, and endometrial carcinoma was 61.5%, 85.7% and 86.0%, respectively, with no significant difference among those three groups (P>0.05). The overexpression (-) rate in the three group was 7.6%, 14.3% and 40.0%, respectively, and the difference among normal endometrium, proliferative endometrium and endometrial carcinoma were significant (P<0.05). With endometrial adenocarcinomatous histological degree increasing, Survivin overexpression positive rate increased, and the differences among G3, G2 and G1 were significant (P<0.05). ② The positive rate of Caspase3 in normal endometrium, proliferative endometrium, and endometrial carcinoma was all 100% with no significant difference among them (P>0.05). However, the overexpression rate was 92.3%, 92.8%, and 60.0%, respectively. The differences among normal endometrium, proliferative endometrium and endometrial carcinoma were significant (P<0.05). In different endometrial adenocarcinomatous histological degrees, G1, G2 and G3, the overexpression rate of Capase3 showed the trend of decrease; however, there was no significant differences among the three groups (P>0.05). ③ The overexpression of Survivin and the expression of Caspase3 in endometrial carcinoma showed negative correlation (rs=0.287, P<0.05). Conclusion In endometrial carcinoma, the expression of suvivin increased, whereas the expression of Caspase3 decreased. The ability to suppress apoptosis enhanced, whereas the ability to promote apoptosis reduced. The balance between proliferation and apoptosis was broken, which might be one of the causes of developing endometrial carcinoma and related to its biological malignant behavior.
KEY WORDS: endometrial carcinoma; Survivin; Caspase3
子宫内膜癌是妇科临床常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升。肿瘤分子生物学研究表明,细胞凋亡与许多疾病的发生有关,并且在肿瘤生长和侵袭中发挥重要作用。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein, IAP)新成员,参与细胞凋亡的调控;Caspase3是细胞凋亡的真正执行者。为了探讨凋亡调控因子Survivin和Caspase3在子宫内膜癌发生发展中的作用,我们采用免疫组化SP法对13例正常子宫内膜、28例增生性子宫内膜及50例子宫内膜癌中Survivin和Caspase3表达进行了研究。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选取我院刮宫及手术切除标本的存档蜡块共91例，其中正常子宫内膜13例(增生期8例，分泌期5例)，增生性子宫内膜28例(单纯型增生13例，复杂型增生7例，不典型增生8例)，子宫内膜腺癌50例。所有子宫内膜癌均经病理证实，术前均未接受过放疗或化疗，所有病例在年龄等因素中组间有可比性(P>0.05)，按FIGO标准，子宫内膜腺癌细胞分化G1 23例，G2 17例，G3 10例。
1.2 实验方法 取常规固定、包埋的组织标本，5μm连续切片，分别用于HE和免疫组化染色。兔抗人Survivin多克隆抗体Sc10811购自北京中山生物技术有限公司，兔抗人Caspase3多克隆抗体BA0588购自博士德生物工程有限公司，工作浓度均为1∶50，SP试剂盒系Zymed 公司产品，实验步骤按试剂盒说明书进行，用PBS缓冲液代替第一抗体作为阴性对照。
1.3 结果判定 细胞质和(或)细胞核有棕黄色颗粒者为Survivin阳性，细胞质有棕黄色颗粒者为Caspase3阳性。根据染色强度及阳性细胞百分率进行综合评定。染色强度以不着色为0分，着淡黄色为1分，着黄色为2分，着棕黄色为3分;阳性细胞百分率：<5%为1分，5%-25%为2分，26%-50%为3分，>50%为4分。将每张切片染色强度与阳性细胞百分率得分相乘的积为其最后得分。0-1分为阴性(-)，2-3分为弱阳性(+)，4-6分为中等阳性()，>6分为强阳性()。-～+为表达缺失、低表达， -为过表达，+-均为阳性。
1.4 统计学处理 采用χ2检验，Fisher’s确切概率法，等极相关分析采用非参数spearman检验，以P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 不同组织中Survivin蛋白的表达 Survivin蛋白阳性染色主要定位于腺上皮细胞或肿瘤细胞的胞浆内，少数有核浆共存现象，呈棕黄色颗粒(图1)。Survivin在正常子宫内膜、增生性子宫内膜、子宫内膜癌中都有不同程度的阳性表达，其表达阳性率3组间无统计学差异(P> 0.05)。但是，3组过表达率呈上升趋势，分别为7.6%、14.3%、40.0%。子宫内膜癌与正常子宫内膜及增生性子宫内膜比较，均有统计学差异(P<0.05)，正常子宫内膜与增生性子宫内膜比较，亦无统计学差异(P>0.05)。子宫内膜腺癌不同组织学分级中，Survivin阳性表达无显著性差异(P>0.05)，但过表达率G2 、G3明显高于 G1，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。
图1 子宫内膜癌中Survivin蛋白阳性表达(略)
Fig.1 The expression of Survivin in endometrial carcinoma (× 400)
2.2 不同组织中Caspase3蛋白的表达 Caspase3蛋白阳性染色主要定位于腺上皮细胞或肿瘤细胞的胞浆中，呈棕黄色颗粒(图2)。正常子宫内膜、增生性子宫内膜、子宫内膜癌Caspase3蛋白表达阳性率均为100%，3组表达阳性率间无统计学差异(P>0.05)。3组过表达率分别为92.3%、92.8%、60.0%。子宫内膜癌与正常子宫内膜及增生性子宫内膜比较,均有统计学差异(P<0.05)。子宫内膜腺癌不同组织学分级中，Caspase3蛋白过表达阳性率随细胞分化程度不良有下降趋势，G1组65.2%，G2组58.8%，G3组50.0%，但各组间无显著性差异(P>0.05，表2)。
表1 Survivin蛋白在正常子宫内膜、增生性子宫内膜及子宫内膜癌中的表达(略)
Tab1e 1 Expression of Survivin in normal endometrium, proliferative endometrium and endometrial carcinoma
图2 子宫内膜癌中Caspase3蛋白的阳性表达(略)
Fig.2 Expression of Caspase3 in endometrial carcinoma (× 200)
表2 Caspase3在正常子宫内膜、增生性子宫内膜及子宫内膜癌中的表达(略)
Table 2 Expression of Caspase3 in normal endometrium, proliferative endometrium and endometrial carcinoma
2.3 Survivin与Caspase3表达的相关性 子宫内膜癌组织中 Survivin过表达与 Caspase3表达呈负相关(rs=0.287，P<0.05)。
3 讨论
细胞凋亡是调节细胞数目及生命活动的一个主动性死亡过程。近年来，它在肿瘤发展过程中的生物学作用受到普遍关注。细胞凋亡受基因调控，凋亡调节紊乱有助于细胞的恶性转化和肿瘤的进展。Survivin是 IAP家族新成员，参与细胞凋亡的调控，其蛋白产物抑制细胞凋亡。Survivin的组织分布具有明显的细胞选择性，表达于胚胎和发育的胎儿组织，在终末分化的绝大多数成人组织(胸腺、生殖腺除外)不表达。研究表明， Survivin几乎在所有被检测过的肿瘤组织中，如胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌等都有不同程度的表达，且Survivin的表达与多种肿瘤的生物学特性和(或)疾病分期有关[13]。Survivin组织分布的特异性及其在肿瘤组织特异性表达，有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。Survivin是通过抑制凋亡通路下游Caspase3、Caspase7的活性而发挥抗凋亡作用。关于Survivin与子宫内膜癌的关系，Takai等[4]研究表明，Survivin在正常子宫内膜中有微弱表达，而在子宫内膜癌组织的细胞核和(或)细胞质中均可见到Survivin大量表达，其表达与子宫内膜癌的PCNA标记指数、临床分期、细胞学分级、肌层浸润深度、临床疗效、生存率等显著相关，认为Survivin可作为诊断子宫内膜癌的标志物。Lehner等[5]用RTPCR法检测正常子宫内膜和子宫内膜癌中Survivin mRNA的表达，结果发现在子宫内膜腺癌中，其表达水平随着细胞学分级的升高而上升，表明Survivin的表达是子宫内膜癌进展过程中可能存在的一种重要机制。史惠蓉等[6]研究表明Survivin阳性表达率与子宫内膜癌组织的恶性程度明显相关，可用来鉴别肿瘤恶性程度、预测预后。本实验结果显示，正常子宫内膜、增生性子宫内膜及子宫内膜癌组织中均有不同程度的Survivin蛋白阳性表达，三组表达阳性率间虽然无显著性差异，但是Survivin蛋白过表达阳性率呈上升趋势，子宫内膜癌与正常子宫内膜及增生性子宫内膜比较均有显著性差异。随着子宫内膜腺癌组织学分级的升高，Survivin蛋白过表达阳性率也升高，G3、G2与G1相比均有显著性差异。推测Survivin可能在子宫内膜癌发生中起一定作用，并且与子宫内膜癌细胞分化不良及恶性程度有关。Survivin过度表达，细胞失去了正常增殖周期中凋亡“开关”(checkpoint)的限制，造成细胞增殖增加，凋亡减少，细胞增殖与凋亡平衡打破，最终导致癌症发生。Caspase3是细胞凋亡过程中重要的效应分子，通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中，Caspase3活化主要有两条途径：一是经细胞表面膜受体如Fas、TNFR1等活化;另一条途径是死亡刺激因子作用下线粒体释放细胞色素C，活化的Caspase3通过裂解一系列底物而引起细胞凋亡。体外实验证实Caspase3活化的两条途径都可被Survivin抑制[7]。 Peiro等[8]应用免疫组化方法研究了子宫内膜癌组织中细胞凋亡易感基因(cellular apoptosis susceptibility, CAS)，Caspase3，Bcl2、Bax的表达及与预后的关系，发现子宫内膜癌组织中Caspase3、Bax表达升高，Bcl2表达降低，Caspase3与Bax表达呈正相关，与Bcl2呈负相关。肿瘤组织中Caspase3阳性细胞超过50%的患者生存期缩短。他们认为Caspase3可作为预测预后的指标。本实验中正常子宫内膜、增生性子宫内膜及子宫内膜癌中Caspase3过表达率呈下降趋势，子宫内膜癌组与正常子宫内膜、增生性子宫内膜相比均有显著性差异，而且随子宫内膜癌细胞分化程度的降低，其过表达率也有下降趋势。本试验结果与Peiro等[8]研究有差异。但是，关于Caspase3与其他肿瘤的关系，如胃癌、肝癌、宫颈癌、非霍奇金淋巴瘤等各家报道不一，其是否可作为预测肿瘤预后的指标，有待进一步研究。本实验结果显示子宫内膜癌Survivin过表达与Caspase3表达呈负相关。推测Survivin过表达抑制了Caspase3。可能是由于Survivin直接作用于Caspase3和Caspase7，一方面可以与有活性的Caspase3、7特异性结合，当Caspase3与Survivin结合后，即在细胞内失活;另一方面Survivin也能阻止Caspase3、7的自发激活，抑制细胞凋亡[9]。另外，Survivin还可通过P21间接抑制Caspase3，P21与Caspase3前体结合使Caspase3失活，从而抑制细胞凋亡[10]。还有报道认为，Survivin还可通过非Caspase依赖的途径来抑制细胞凋亡，如参与调节P53依赖的凋亡[11]。子宫内膜癌的发生发展是一个多步骤、多因素的复杂过程。在此过程中，Survivin过表达升高及对 Caspase3抑制作用增强，使细胞凋亡能力降低，导致变异的腺上皮永生化和癌变。但是，Survivin如何在肿瘤组织中被激活、Survivin抑制 Caspase3的机制及Caspase3在肿瘤发生过程中的分子生物学机制，有待进一步研究。
参考文献：
[1]Koch CA,Vortmeyer AO, Diallo R, et al. Survivin: a novel neuroendocrine marker for pheochromocytoma [J]. Eur J Endocrinol, 2002, 146(3):381388.
[2]Ikeguchi M, Ueda T, Sakatani T, et al. Expression of surviving messenger RNA correlates with poor prognosis in patient with hepatocellular carcinoma [J]. Diagn Mol Pathol, 2002, 11(1):3340.
[3]Chakravarti A, Noll E, Black PM, et al. Quantitatively determined survivin expression levels are of prognostic value in human gliomas [J]. J Clin Oncol, 2002, 20(4):10631068.
[4]Takai N, Miyazaki T, Nishida M, et al. Survivin expression correlates with clinical stage, histological grade, invasive behaviorand survival rate in endometrial carcinoma [J]. Cancer Lett, 2002, 184(1):105116.
[5]Lehner R, Enomoto T, McGregar GA, et al. Correlation of survivin mRNA detection with histological dignosis in normal endometrium and endometrial carcinoma [J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2002, 81(2):162167.
[6]史惠蓉，陈志敏，梁爱青. 子宫内膜癌组织中Survivin和PCNA的表达 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2005, 40(3):408410.
[7]Tamm I, Wang Y, Sausville E, et al. IAPfamily protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD95), Bax, Caspase, and anticancer drugs [J]. Cancer Res, 1998, 58(23):3155320.
[8]Peiro G, Diebold J, Baretton GB, et al. Cellular apoptosis susceptibility gene expression in endometrial carcinoma: correlation with Bcl2, Bax, Caspase3 expression and outcome [J]. Int J Gynecol Pathol, 2001, 20(4):359367.
[9]Shin S, Sung BJ, Cho YS, et al. An antiapoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase3 and 7 [J]. Biochemistry, 2001, 40(4):11171123.
[10]Ito T, Shirak K, Sugimoto K, et al, Survivin promotes cell proliferation in human hepatocelluar carcinoma [J]. Hepatology, 2000, 31(5):10801085.
[11]Mirzy A, McGuirk M, Hockenberry TN, et al. Human survivin is negatively regulated by wildtype P53 and participates in P53dependent apoptotic pathway [J]. Oncogene, 2002, 21(17):26132622.
