环氧合酶-2和ki-67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达

　　作者：赵秀敏，吴静，马瑶 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院妇产科，陕西西安 710004 浙江省台州市第一人民医院妇产科，浙江台州 318020

　　【摘要】 目的 研究环氧合酶-2(COX-2)和ki-67在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(CIN)、宫颈鳞状细胞癌(SCC)中的表达及其相关性。方法 RT-PCR法检测COX-2 mRNA在正常、炎性、CIN组织和SCC组织中的表达;免疫组化法检测各组中COX-2和ki-67蛋白的表达。结果 COX-2 mRNA和蛋白在正常组无表达，在炎性、CIN和SCC组表达升高(P<0.05)，COX-2蛋白的表达与肿瘤体积和浸润深度有关(P<0.05)。ki-67在正常组中偶有表达，在炎性组和CIN组表达增高，在SCC组显著增高(P<0.01)。COX-2与ki-67蛋白的表达相关(r=0.675，P<0.001)。结论 COX-2表达增高可能是宫颈癌发生发展的早期事件，与细胞异常增生有关。

　　【关键词】 环氧合酶-2;Ki-67;宫颈癌;细胞增殖

　　Expression of COX-2 and ki-67 in squamous carcinoma of the cervix

　　Zhao Xiumin, Wu Jing, Ma Yao

　　1. Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004;

　　2. Department of Obstetrics

　　and Gynecology of the First People’s Hospital of Taizhou, 318020, China

　　ABSTRACT: Objective To study the expression of cyclooxygenase (COX-2) and ki-67 in chronic cervicitis, cervical intraepithelial neoplasia (CIN), squamous carcinoma of the cervix(SCC)and their relationship. Methods Tissue samples were harvested respectively from normal, inflammational, CIN and 30 SCC tissues. The expression of COX-2 mRNA was detected by RT-PCR method. COX-2 and ki-67 proteins were detected by inmmunohistochemical method. Results The overall expression of COX-2 mRNA and protein was higher in inflammation, CIN and SCC groups than that in normal cervix (P<0.05). COX-2 protein expression was correlated with tumor size and invasion depth (P<0.05). Ki-67 protein was higher in the other groups than that in normal cervix (P<0.05). Ki-67 was expressed in SCC group at a high level, which significantly differed from the expression in inflammation group (P<0.01). A significant correlation was found between COX-2 and ki-67 protein (r=0.675, P<0.001). Conclusion COX-2 may be an early incident of squamous cervical carcinogenesis related to cell proliferation.

　　KEY WORDS: cyclooxygenase-2; ki-67; cervical carcinoma; cell proliferation

　　环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是炎症反应中催化前列腺素合成的一个限速酶。有研究发现COX-2在结肠癌、食管癌、宫颈癌中表达升高，其表达同免疫抑制、血管生成、抗凋亡和细胞增殖有关，影响肿瘤的发生发展[1-3]。ki-67抗原为细胞分裂增殖相关蛋白，可识别生长中的细胞，评估细胞增生[4]。本研究通过检测COX-2和ki-67在宫颈正常组织、慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)、宫颈鳞状细胞癌(squamous carcinoma of the cervix, SCC)中的表达，探讨COX-2在宫颈癌发生发展中的作用和机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源与分组

　　实验分2组，实验组均取自西安交通大学医学院第二附属医院2005年11月至2006年3月手术切除并经病理学证实的标本。其中宫颈癌组30例，患者年龄32-72岁，平均(44.23±8.85)岁;对照组包括，慢性宫颈炎10例，患者年龄29-43岁，平均(30.58±10.25)岁;CIN 10例，患者年龄37-50岁，平均(46.50±3.94)岁;正常宫颈10例，患者年龄29-43岁，平均(37.52±6.84)岁。所有病例术前2 周内均未服用消炎痛、阿斯匹林等影响前列腺素代谢的药物。采得的新鲜组织2份，1份液氮处理后，-80 ℃冰箱冻存以备RT-PCR检测，另1份4%(体积分数)甲醛溶液固定，石蜡包埋，以备免疫组化染色。

　　1.2 RT-PCR法及结果判定

　　β-actin(303 bp)用于内对照，PBS液代替引物作为阴性对照。总RNA提取后，紫外分光光度计(美国Nano Drop ND-100 Spectrophotometer仪)检测RNA纯度(>1.6)，计算出RNA浓度，取2 μg进行RT-PCR。引物设置：COX-2(530 bp)上游引物：AAGCCTTCTCTAACCTCTCC;下游引物：TAAGCACATCGCATACTCTG;β-Actin(303 bp)上游引物：AGCGGGAAATTGTGCATG;下游引物：CAGGGTACCTGGTGGTGCC(由陕西理生医疗科技有限公司合成)。在同一反应体系，按照RT-PCR酶混合物试剂(陕西理生医疗科技有限公司)说明结合参考文献[5]提供的逆转录系统及参数进行RT-PCR：37 ℃反应30 min，95 ℃ 3 min灭活逆转录酶后95 ℃变性30 s，57.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反应30个循环。取扩增产物进行0.5 mg/L琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。用凝胶成像系统进行半定量分析(美国Bio-Rad凝胶成像分析仪，型号：Gel Doc EQ)，取目的基因条带和β-actin条带强度的比值作为目的基因的相对值。

　　1.3 免疫组化染色及结果判定

　　常规切片(4 μm)，脱蜡，柠檬酸沸水修复抗原，其余步骤按SP免疫试剂盒(北京中山试剂公司产品)说明操作。抗COX-2多克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体购自北京中山试剂公司，工作浓度分别为1∶1 200，1∶200。用已知膀胱癌阳性片作阳性对照，PBS液代替一抗作阴性对照。结果判断：COX-2阳性染色主要为胞质，少数为核膜着色。ki-67阳性染色主要为胞核和核膜着色。免疫组织化学标本经Image-proplus图像分析软件进行图像分析[6]，每个标本随机选取3个高倍视野，测定单位面积下平均灰度值，最后求每张切片的平均灰度值及标准差。本次测量灰度值标准，极白为255，极黑为0，共256阶。故染色越浅，灰度值越大;染色越深，灰度值越小，考虑背景色的误差，将灰度值≥200者视为阴性。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据用SPSS 11.5统计软件处理。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间均数比较根据方差是否齐性采用t或t′检验，等级资料采用Spearman相关系数分析，两组计量资料之间的关系采用Pearson相关系数分析，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 COX-2 mRNA和蛋白的表达

　　COX-2蛋白在正常组无表达，炎性、CIN组、SCC组表达依次升高，与正常组比较具有统计学差异(P<0.05)，但病变各组间无统计学差异(P>0.05，表1)。宫颈病变各组COX-2蛋白表达阳性率增高。COX-2 mRNA在正常组不表达，宫颈病变各组表达升高(图1)，但与蛋白表达不完全一致(r=0.135，P=0.68)。表1 COX-2在不同的宫颈组织中的表达(略)

　　2.2 ki-67蛋白在宫颈组织中的表达

　　ki-67在正常宫颈组偶有表达，炎性、CIN和SCC组中表达依次升高，与正常组比较具有统计学差异(P<0.05)，炎性组同SCC组比较具有统计学差异(P<0.01，表2)。宫颈病变各组ki-67蛋白表达阳性率增高，COX-2在CIN和SCC组表达阳性率高于ki-67。

　　2.3 COX-2和ki-67蛋白表达范围及其与临床病理特征的关系

　　炎性和CIN组中，ki-67主要分布在宫颈的副基底层细胞(parabasal squamous cells)(图2、3)，SCC组中ki-67表达于肿瘤细胞和血管内皮细胞(图4、5)。COX-2表达范围较ki-67广泛。CIN组COX-2除表达于副基底层异常的细胞外，病灶周围正常细胞及炎性细胞也有表达，偶见于新生血管内皮细胞，其表达随着与病灶距离的增加而减弱(图2、3);SCC组COX-2除表达于肿瘤细胞外，癌灶周围的炎性细胞及血管内皮细胞也有表达(图4、5)。COX-2蛋白表达与肿瘤的体积和浸润深度有关(P=0.04，P=0.02)，ki-67表达与任何病理特征均无关(表3)。宫颈病变各组ki-67和COX-2的蛋白表达存在显著直线相关(r=0.675，P<0.001，图6)。

　　表2 ki-67蛋白在宫颈组织中的表达(略)表3 COX-2和ki-67蛋白在SCC组中的表达(略)

　　3 讨 论

　　持续性人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是CIN或宫颈癌发生的一个重要驱动力[4]。HPV清除与细胞介导免疫高度相关[7]。Huan等[8]比较宫颈癌癌灶和癌周组织的细胞因子，发现白介素-10(interleukin-10, IL-10)在肿瘤组织中的表达增强，后者与体液介导免疫有关。在慢性炎症过程中，机体的免疫反应由细胞介导免疫转化为体液介导免疫，COX-2在这一过程中起着重要作用。研究发现COX-2与人类肿瘤关系密切，其作用机制可能与免疫抑制和细胞增殖有关。ki-67是一个细胞增殖的重要分子标记物。宫颈上皮中，ki-67阳性细胞核的分布范围，可以将CIN病变等级准确分类[4]。

　　John[9]研究在CIN病灶周围的正常细胞，轻度、中度、重度病变细胞中COX-2的表达阳性率，分别为10%、28%、37%、67%，病灶切缘COX-2的表达还可作为一个监测CIN预后的独立指标(相对危险度=0.68)。John考虑到COX-2染色超过病灶组织平均约1.6 mm，故宫颈环状电切术(loop electrosurgical excision procedure, LEEP)切除的组织应超过CIN病灶2 mm以防止复发。这一研究提示COX-2表达阳性的细胞，即使组织学形态仍然正常，其生物学行为已经发生改变，易于发展为CIN。本实验中，CIN组，COX-2在病变细胞及其周围正常细胞均有表达，其表达范围随着与病灶距离的增加而减弱;SCC组COX-2蛋白的表达与肿瘤体积和浸润深度相关(P=0.04，P=0.02)。提示COX-2可能参与宫颈癌病变的发生发展。

　　Kim等[3]发现宫颈癌中COX-2表达增高的组，其ki-67表达阳性率也增高，故认为COX-2表达与ki-67相关。Ferrandina等[10]应用COX-2抑制剂治疗宫颈癌，发现其可以抑制癌细胞增殖，使ki-67表达降低。本实验中，COX-2与ki-67表达存在显著正相关(r=0.675，P<0.001)。ki-67与COX-2蛋白表达范围不同，在CIN和SCC组中，ki-67仅在病灶中表达，COX-2在病灶及其周围组织均表达，其表达阳性率高于ki-67。结果提示：COX-2表达增高是较ki-67更早的细胞生物学行为。不同于ki-67仅表达于病变组织，COX-2在CIN病灶周围正常组织中表达增高，使细胞生物学行为改变，调节宫颈组织局部免疫，促进细胞增殖，产生一个更利于细胞恶变的微环境，影响肿瘤的发生发展和预后。

　　COX-2促进细胞增殖的确切机制尚不十分清楚，可能与其主要产物PGE2有关。

　　Dai等[5]发现COX-2 mRNA和蛋白在宫颈病变各组的表达升高，mRNA表达阳性率高于蛋白，认为COX-2可能存在转录后调节。Debnath等[11]研究宫颈癌细胞株紫外线照射下不同时段COX-2的表达，认为射线刺激COX-2 mRNA表达量增高，而mRNA稳定因子CUGBP2表达也升高，COX-2蛋白表达被抑制，其量没有明显改变。本实验中，COX-2 mRNA和蛋白在宫颈病变各组表达均升高，但两者表达不完全一致(r=0.135，P=0.68)。这种差异是否与这一稳定因子有关尚待进一步研究。

　　COX-2蛋白表达增高可能是细胞生物学行为改变的早期事件。COX-2通过调节宫颈局部免疫，影响细胞增殖，促进一个更利于细胞恶变的环境产生，促使宫颈由慢性宫颈炎向CIN和SCC转变。COX-2在宫颈癌早期发生阶段起着重要作用，这为预防宫颈癌提供了新的思路。

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