人宫颈癌FHIT基因的表达改变与HPV16感染的关系

　　作者：韩瑾，陈葳，李旭 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院实验医学中心，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 探讨FHIT基因表达改变和HPV16感染与人宫颈癌发生的关系。方法 采用反转录-巢式聚合酶链反应方法测定5种人宫颈癌细胞株(SiHa、HeLa、RJC-1、CS1213、C4-1)和58例宫颈癌组织与18例正常宫颈对照中FHIT mRNA的表达;回收7例FHIT基因不同的转录扩增产物，纯化后进行DNA测序;PCR技术检测组织中HPV16型的感染状况。结果 SiHa、HeLa和C4-1宫颈癌细胞中有FHIT基因转录异常; 宫颈癌组织中39例(67.2%)存在FHIT基因异常表达，显著高于正常对照组0例(0%)(P<0.05);37例(63.8%)有HPV16感染，显著高于正常对照组1例(5.0%)(P<0.05)。宫颈癌组织中有HPV16感染患者的FHIT基因表达异常数(30/37)显著高于HPV16未感染的患者(9/21)，二者之间存在相关性(P<0.01);FHIT基因的异常表达和HPV16的感染与患者的年龄、临床分期、肿瘤直径、病理分级及是否伴淋巴结转移无相关性(P>0.05)。序列分析发现FHIT基因转录本主要存在不同程度的外显子的缺失，以第5位和第6位外显子的缺失为主，未见未知序列的插入和点突变。结论 FHIT基因在人宫颈癌组织中的异常表达率明显增高，且与HPV16的感染有关，这些改变可能在人宫颈鳞癌的发生中起着重要作用。

　　【关键词】 宫颈癌;FHIT基因;基因缺失;人乳头瘤病毒(HPV)

　　Fragile histidine triad transcription abnormalities and human　papillomavirus16 infection in human cervical carcinoma

　　Han Jin, Chen Wei, Li Xu

　　Center for Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To evaluate the relationship between fragile histidine triad (FHIT) transcription abnormalities and HPV16 infection and human cervical tumorigenesis. Methods Total RNA from 5 cervical carcinoma cell lines (SiHa, HeLa, RJC-1, CS1213 and C4-1), 58 primary cervical cancer specimens and 18 normal cervical epithelial tissues were extracted and FHIT transcripts were characterized by a two-step(nested) reverse transcription (RT)-PCR. The seven of the PCR products with different size were purified and sequenced. HPV16 infection was assessed by PCR. Results ① There were altered FHIT transcripts in SiHa, HeLa and C4-1 cells. Aberrant FHIT transcripts were detected in 39 out of the 58 cervical cancer samples (67.2%), but none out of 18 in the normal cervix tissue specimens (0%); HPV16 infections were identified in 37 of the 58 cervical cancer tissues (63.8%), but 1 in the 18 normal cervical epithelial tissues (5%), which showed a significant difference between these two groups (P<0.05). ② The number of partial deletions of the FHIT gene in the group with HPV16 infection (29/37) was significantly higher than that in the group without HPV16 infection (9/21) and the correlation was found between aberration of FHIT transcript and HPV16 infection. There was no obvious difference in age, stage, tumor size, grade and lymph node metastasis between the groups with and without FHIT abnormalities and HPV16 infection (P>0.05). ③ The exon 5 and exon 6 were mainly deleted in the altered FHIT transcripts and no insertion and point mutation were found by DNA sequencing. Conclusion Aberrant FHIT expression was significantly common in cervical cancers and was correlated with HPV16 infection. These findings suggest that the tumor suppressor gene FHIT and high risk HPV16 may play a very important role in human cervical carcinogenesis.

　　KEY WORDS: cervical cancer; fragile histidine triad (FHIT); deletion; human papillomavirus 16 (HPV16)

　　子宫颈癌是世界范围内女性第二位常见的恶性肿瘤，每年死亡人数超过27万[1]。研究表明子宫颈癌的发生与高危型HPV感染和宫颈组织内众多基因表达改变有关，包括HPV16和定位于染色体3p14.2的脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad, FHIT)基因等[2-3]。由于FHIT基因区域覆盖3p上的HPV16的整合位点，两者在子宫颈癌发生中的作用及其相互关系值得探讨[4]。本研究采用RT-PCR方法在宫颈鳞癌中检测FHIT基因的转录表达，并同时检测HPV16的感染情况，现将结果报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 细胞株

　　5种宫颈癌细胞株(SiHa、HeLa、RJC-1、CS1213、C4-1)均由西安交通大学医学院第一附属医院实验医学中心提供，其中CS1213和RJC-1细胞为该中心实验室自建[5]。

　　1.1.2 临床病例

　　选择2003年9月至2004年5月间西安交通大学医学院第一附属医院妇产科和肿瘤科初诊初治的宫颈癌患者58例，年龄39-70岁，均无内外科合并症。病理类型均为鳞状细胞癌;临床分期[按国际妇产科联盟(FIGO)标准,2000年]：Ⅰ期18、Ⅱ期24例、Ⅲ-Ⅳ期16例;病理分级：Ⅰ级10例、Ⅱ级22例、Ⅲ级26例;有盆腔淋巴转移7例，无转移51例。正常对照18例为同期患良性子宫肌瘤或功能性子宫出血行全子宫切除术，术后宫颈组织病理检查报告为正常宫颈上皮，无其他疾病，年龄38-62岁。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 标本采集

　　宫颈癌细胞生长在RPMI-1640培养基(含100mL/L的新生小牛血清，100 u/mL的青霉素，100 u/mL链霉素)，37 ℃，5%(体积分数)的CO2条件下传代培养，收集时用2.5 g/L(0.25%)胰蛋白酶消化，PBS缓冲液洗涤，离心管(均经DEPC水处理，高压蒸汽消毒)收集，每支离心管细胞数达到5×106-10×106。组织标本取宫颈癌患者手术切除或放疗前活检标本，避开坏死和炎症区域，组织块大小0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，同法收集正常宫颈组织。收集的细胞及组织在30 min内置液氮中保存，所有标本均经病理检查证实。

　　1.2.2 引物设计

　　FHIT和HPV16基因的引物序列参照文献[3]，并与GeneBank中基因序列人工验证核实后，由上海生物工程公司合成，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照(表1)。表1 引物DNA序列(略)

　　1.2.3 总RNA的提取

　　采用TrizoL试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，于紫外分光光度计(美国Bio-RAD公司) 测波长分别为260 nm和280 nm的吸光度(A)值，选用A260/A280为1.8-2.0的样本用于RT反应。

　　1.2.4 cDNA的合成

　　采用大连宝生物工程有限公司生产的RNA反转录试剂盒，按说明书操作。电泳检测cDNA图像呈明显片状者用于PCR扩增，并于-20 ℃保存备用。

　　1.2.5 FHIT基因扩增

　　采用大连宝生物工程有限公司生产的PCR试剂盒进行巢式PCR扩增，第一轮和第二轮扩增反应体系均为50 μL，含试剂盒反应液15 μL，FHIT基因引物和β-actin上、下游引物各20 pmol，加灭菌水至50 μL，用PE 2400型扩增仪完成PCR扩增，两轮扩增条件均为：94 ℃预变性2 min后，94 ℃变性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

　　1.2.6 回收和纯化FHIT的转录片段

　　随机选取扩增异常FHIT基因的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳后切下含有目的DNA条带，用大连宝生物工程有限公司生产的纯化试剂盒纯化，由上海博亚生物工程公司进行产物测序。

　　1.2.7 HPV16基因扩增

　　采用美国Omega公司试剂盒提取宫颈癌细胞及组织DNA，测定A260/A280值并计算DNA浓度，1-5 μg的DNA用于PCR扩增，检测HPV16 DNA。

　　1.2.8. 统计学处理

　　采用SPSS10.0进行统计分析，数据采用χ2检验，设定α=0.05为统计检验的显著标准。

　　2 结 果

　　2.1 FHIT基因mRNA的表达

　　5种人宫颈癌细胞株均可检测出FHIT基因，其中CS1213和RJC-1细胞中为正常的基因转录片段，SiHa、HeLa和C4-1细胞中为截短的基因转录产物。宫颈癌患者中有FHIT基因表达片段异常者39例(67.2%)，正常对照组无1例(0%)，两组之间有显著性差异(表2)。表2 宫颈癌和正常宫颈组织中FHIT基因表达改变和HPV16感染的关系(略)

　　2.2 HPV16DNA的检测

　　宫颈癌细胞株SiHa、RJC-1有HPV16感染;宫颈癌患者中HPV16感染者37例(63.8%)，正常对照组1例(5%)，两组比较存在显著性差异P<0.05)。宫颈癌组织中有HPV16感染患者的FHIT基因表达异常数为30/37，显著高于HPV16未感染的患者(9/21)，FHIT基因表达异常和HPV16感染之间有相关性(χ2=8.886, P<0.01)。

　　2.3 FHIT基因异常和HPV16感染与宫颈癌患者的临床分期、病例分级和淋巴节转移的关系

　　不同年龄、病理分级、肿瘤直径、临床分期及盆腔淋巴结转移与否的宫颈癌组织中FHIT基因转录异常片段分别进行比较，差异均无显著性(表3)。 表3 FHIT基因异常和HPV16感染与宫颈癌患者的临床指标的关系(略)

　　2.4 FHIT基因DNA测序的结果

　　FHIT基因转录本的改变主要是外显子缺失, 异常序列包括：第4到第9外显子之间出现缺失片断，即缺失第5、第6、第7外显子;第3到第8外显子出现缺失片断，即缺失第4、第5、第6、第7外显子;第4到第9外显子，即缺失第5、第6、第7、第8外显子;第4外显子的缺失，即从第3到第5外显子。测序未发现插入序列和点突变(图1、图2)。

　　3 讨 论

　　本研究通过检测FHIT基因在正常宫颈上皮和鳞状细胞癌中的转录改变，从而探讨FHIT基因mRNA表达异常对人宫颈鳞癌发生、发展的影响。结果发现FHIT基因在正常宫颈组织中均有低水平表达，而在宫颈癌衍生细胞株和宫颈癌组织中存在高频率的FHIT基因的表达异常，主要为明显的、连续的大片段的缺失。提示FHIT基因的改变可能在宫颈癌的发生中起重要作用。异常FHIT转录产物多集中在350 bp和400 bp大小，与Teresa等[6]研究结果类似，经测序证实主要是外显子5、6、7和外显子4、5、6两种类型的缺失所致。FHIT基因外显子5中包含有FHIT基因ORF起始密码子，外显子5的缺失会导致ORF完整性破坏，故其转录产物的异常将引起FHIT基因功能失活。

　　扩增产物经电泳分析还发现FHIT基因异常的转录产物与正常大小FHIT转录本并存。产生这种现象的原因可能是由于FHIT基因变异发生在单等位基因上，剩余的等位基因仍能转录野生型cDNA，即FHIT基因部分片段的杂合性缺失[7]。同时，由于染色体3p14.2区域存在脆性位点FRA3B，使该区基因组不稳定，细胞受到内外环境因素的作用可产生FRA3B的断裂，影响FHIT基因的转录[3,8]。另外，还可能与宫颈癌组织中细胞的异质性有关，即宫颈癌灶由不同的细胞克隆构成，而某些细胞克隆未发生FHIT基因缺失;不同的癌细胞克隆中FHIT基因缺失部位也可能不同。

　　人宫颈癌前病变和鳞癌组织中高危型HPV的感染率很高，其E6、E7癌基因的整合影响P53基因和RB基因的功能[9-10]，加之HPV16整合位点可位于FHIT基因外显子4和5之间，有引起FHIT基因的表达异常的可能性[4,11]。本研究发现宫颈癌组织中HPV16感染的患者FHIT基因表达异常显著增加，两者呈正相关关系,与Wang[12]在肺癌研究方面的结果一致。推测HPV16在整合过程中可能诱导FHIT基因外显子缺失，使FHIT转录物异常而导致蛋白功能失活，引起二腺苷酸三磷酸水解酶(Ap3A)水平提高，刺激、加强或阻断生长抑制途径、细胞凋亡途径以影响肿瘤的发生。因此，FHIT基因的改变与HPV的感染可能对肿瘤发生起协同作用。

　　另外，从我们的结果仅反映出FHIT基因片段的缺失与宫颈癌的发生有关, 不能证实其改变是癌前病变或患者早期诊断的分子标志物, 还是参与宫颈癌进展的晚期事件，或作为判定患者预后的指标[13]。因此，还有必要扩大样本量，采用前瞻性的方法和综合分析技术，进一步明确FHIT基因表达异常在宫颈癌中的生物学作用以及与其他因素的关系。

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