5氨基乙酰丙酸光动力疗法对人卵巢癌细胞的杀伤作用

　　作者：焦慧，王海燕，张友忠 作者单位：(山东大学齐鲁医院妇产科，山东济南 250012)

　　【摘要】 目的 探讨5氨基乙酰丙酸(5aminolevulinic acid, 5ALA)介导的光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)对体外培养的人卵巢癌3AO细胞的杀伤效应。方法 显微镜观察细胞形态;MTT法检测5ALA介导的PDT(5ALAPDT)对3AO细胞增殖的抑制作用;PI染色及Annexin VPI双染结合流式细胞术分析5ALAPDT对3AO细胞的细胞周期及死亡方式的影响。结果 5ALAPDT后3AO细胞出现典型的凋亡形态学改变;细胞抑制率随着5ALA浓度及激光能量密度的升高而升高(P<0.01)，当光敏剂浓度达到一定水平时，抑制率不再相应升高，该作用存在浓度饱和现象;流式细胞术显示PDT后细胞发生了G0/G1期生长停顿(P<0.05)，有明显的晚期凋亡和继发性坏死(P<0.01)。结论 5ALA对卵巢癌3AO细胞有杀伤作用;凋亡是5ALAPDT杀伤卵巢癌细胞的一种机制。

　　【关键词】 5氨基乙酰丙酸;光动力疗法;卵巢癌;凋亡

　　Effects of photodynamic therapy with 5aminolevulinic acidon human ovarian carcinoma 3AO cells in vitroJIAO Hui, WANG Haiyan, ZHANG Youzhong

　　(Department of Obstetrics & Gynecology, Qilu Hospital of

　　Shandong University, Jinan 250012, China)ABSTRACT: Objective To study the effects of 5aminolevulinic acid (5ALA) mediated photodynamic therapy (PDT) on human ovarian carcinoma 3AO cells in vitro. Methods Morphological changes were examined by microscopy; the inhibitory effects of 5aminolevulinic acid mediated photodynamic(5ALAPDT) on 3AO cells were examined by MTT assay; cell cycle of 3AO cells was observed by flow cytometry with PI staining; the modality of 3AO cell death induced by 5ALAPDT was determined by flow cytometry with Annexin VPI staining. Results Typical morphological changes of apoptosis occurred after 5ALAPDT. The inhibition rate of cells increased gradually with the increase of 5ALA concentration and laser irradiation dose (P<0.01). 5ALAPDT caused G0/G1 phase arrest of 3AO cell cycle (P<0.05). The late apoptosis and secondary necrosis rates of ovarian carcinoma 3AO cells significantly increased after photodynamic therapy, and they were higher than those of the controls, respectively (P<0.01). Conclusion 5ALA has a killing effect on ovarian carcinoma 3AO cells; apoptosis might be one of the mechanisms of 5ALAPDT on ovarian carcinoma.

　　KEY WORDS: 5aminolevulinic acid (5ALA); photodynamic therapy; ovarian carcinoma; apoptosis

　　卵巢癌为女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，死亡率位居首位。70%的卵巢癌患者就诊时已属疾病晚期，5年存活率只有15%～20%，约有50%～80%的患者将在近期或远期出现复发。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)作为一种新的高选择性肿瘤治疗方法[1]，有望成为卵巢癌新的辅助治疗手段。5氨基乙酰丙酸(5aminolevulinic acid, 5ALA)是第2代光敏剂，具有光敏活性高、体内清除速度快、应用后避光时间短等优点[23]。5ALA诱导的光动力治疗已应用于治疗各种体表肿瘤，如基底细胞癌、鳞状细胞癌等，但国内尚未见到以5ALA作为光敏剂的PDT对卵巢癌细胞杀伤作用的实验研究。本研究探讨5ALA介导的PDT对体外培养的人卵巢癌3AO细胞的杀伤效应。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人卵巢癌细胞株3AO由山东大学齐鲁医院生物工程中心保存;5ALA购自上海张江生物有限公司;RPIM1640购自Hyclone公司;新生牛血清购自杭州四季青公司;碘化丙啶(PI)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司;胰酶、Rnase、二甲基亚砜(DMSO)、丫啶橙(AO)购自Gibco公司;Annexin VPI双染试剂盒购自Biovison公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 人卵巢癌细胞株3AO培养于含100mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液中，细胞均呈单层贴壁生长，在50mL/L CO2、饱和湿度、37℃孵箱内常规培养。2.5g/L的胰酶消化，每3d传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

　　1.2.2 照射方式 光动力治疗机的红光(波长630nm，功率300mW)经光导纤维引出后，垂直照射细胞。

　　1.2.3 实验分组 实验分为正常对照组、单纯光敏剂组、单纯激光组及5ALAPDT组。

　　1.2.4 细胞形态学观察 取对数生长期细胞接种于6孔板中，培养36h，以1.0mmol/L 5ALA、激光能量密度2.5J/cm2照射后，于3、6、12、24h在显微镜下观察;消化收集5ALAPDT后6h细胞，PBS清洗后重悬，调整细胞密度为1.0×105/mL，加入AO(100mg/L)，使其终质量浓度为5mg/L，混匀，荧光显微镜下观察。

　　1.2.5 5ALAPDT后细胞抑制率的检测 常规消化、收集处于对数生长期的细胞，以RPMI1640培养液重悬，计数，以每孔1.0×104个细胞接种于96孔细胞培养板上，在50mL/L CO2、饱和湿度、37℃ 孵箱内常规培养36h，弃培养液。单纯光敏剂组与5ALAPDT组每孔加入不同浓度(0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L)5ALA 0.15mL;单纯激光组与正常对照组加入无血清RPMI1640培养液。每组均设4个复孔，孵箱内避光培养4h。单纯激光组与5ALAPDT组以不同能量密度的激光(1.25、2.5、5.0、10.0J/cm2)进行照射，照射后所有细胞换成含血清的RPMI1640培养液，孵箱内继续避光培养24h，进行MTT比色分析。以490nm为测量波长测其A值。根据下述公式计算各组细胞的抑制率：抑制率=(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。实验重复3次。

　　1.2.6 5ALAPDT后细胞周期变化的检测 使用流式细胞仪结合PI单染检测5ALAPDT对3AO细胞周期的影响。取对数生长期细胞常规消化种于6孔板中，贴壁后36h换成无血清RPMI1640过夜使细胞同步化，5ALA浓度为1.0mmol/L，以激光能量密度为2.5J/cm2的激光照射后继续培养6、12、24h，分别收集5000个细胞，PI单染，上机检测。实验重复3次。

　　1.2.7 5ALAPDT后细胞死亡方式的检测 使用Annexin VPI双染试剂盒结合流式细胞仪，检测5ALAPDT后细胞的死亡方式。取对数生长期细胞常规消化种板，贴壁后常规培养36h，以不同浓度的5ALA(0.1、0.25、0.5、1.0、2.0mmol/L)处理3AO细胞，4h后以2.5J/cm2激光能量密度照射。激光照射后继续培养24h后采集细胞，行Annexin VPI双染色，FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司产品)检测，计数3×105个细胞，分析细胞的死亡方式。具体实验方法根据试剂盒说明书进行。实验重复3次。

　　1.2.8 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件行统计分析。实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，两两比较采用SNK检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态学变化 正常的3AO细胞呈单层梭形贴壁生长，胞核圆形或椭圆形;5ALAPDT(1.0mmol/L, 2.5J/cm2)后，镜下可见3AO细胞胞突回缩，逐渐变圆，折光性减弱，贴壁能力下降，细胞间隙增大，直到细胞漂浮死亡(图1)。AO染色后，未经5ALAPDT处理的细胞核表面光滑，发出均匀黄绿色荧光;5ALAPDT后6h细胞核固缩，呈浓染的块状或颗粒状，发出致密的荧光，并可见明显的凋亡小体(图2)。

　　2.2 5ALAPDT对3AO细胞增殖的影响 单纯激光组对细胞增殖无影响(P>0.05);单纯光敏剂组当5ALA<2.0mmol/L时对细胞增殖无明显影响(P>0.05)，>2.0mmol/L时抑制率升高(2.0mmol/L,5.12%;4.0mmol/L,9.16%)，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。5ALAPDT后随着药物浓度以及激光能量密度的增加，细胞抑制率呈上升趋势，各组间差异有统计学意义(P=0.000);当激光能量密度相同，5ALA浓度在2.0～4.0mmol/L时，细胞抑制率无明显改变(P>0.05)。5ALAPDT后24h细胞抑制率曲线见图3。

　　图3 不同浓度5ALA及不同激光能量密度对3AO细胞的抑制作用

　　Fig.3 Effects of 5ALA concentration and laser dosage on the inhibition rate of 3AO2.3 5ALAPDT对3AO细胞细胞周期的影响 正常对照组、单纯激光组、单纯光敏剂组未见到明显的周期阻滞( P>0.05)，5ALAPDT组G0/G1期比例显著增加，而S期和G2/M期比例明显下降，且呈时间依赖性变化。5ALAPDT作用24h后其G0/G1期比例达到(78.89±0.92)%，与PDT 0h相比差异有统计学意义(P<0.01，表1)。表1 5ALAPDT作用后3AO细胞的细胞周期阻滞现象

　　2.4 5ALAPDT后细胞的死亡方式 实验采用Annexin VPI双染结合流式细胞仪定量检测5ALAPDT后24h人卵巢癌细胞株3AO细胞的死亡方式。结果显示，单纯光敏剂组和单纯激光组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率、继发坏死率与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05);随着光敏剂浓度的升高，细胞的晚期凋亡率、总凋亡率、继发性坏死率明显升高，各组间差异有统计学意义(P<0.01)。当5ALA浓度为2.0mmol/L时，PDT后24h人卵巢癌细胞株3AO细胞的总凋亡率达(80.31±2.47)%，其中以晚期凋亡为主，达(78.59±2.92)%;继发性坏死率达到(18.62±1.42)%(P<0.01)。细胞的早期凋亡率未随着光敏剂浓度的增加而升高，其中0.1mmol/L、0.25mmol/L两个实验组，早期凋亡率与其他实验组相比明显升高，分别为(6.28±0.97)%和(8.38±1.15)%(P<0.01，表2)。

　　3 讨 论

　　光动力学疗法是指在靶细胞内的光敏剂受到合表2 5ALAPDT后细胞死亡方式的比较

　　* P<0.01 vs. control group; ▲P<0.01 vs. different concentration of 5ALA in 5ALAPDT groups适波长的光激发后产生活性氧物质，破坏细胞膜、细胞器导致细胞死亡。光动力治疗突出的优点在于杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞影响较小，毒副作用轻[45]。因此，对于手术难于切除或者腹腔内弥漫性复发的卵巢癌病灶，可通过静脉或局部给予光敏剂后，于手术过程中或通过腹腔镜将光源导入腹腔内，进行PDT治疗去除病灶。

　　光动力治疗中的关键因素为光敏剂的选择，不同的光敏剂对肿瘤细胞的杀伤作用及对正常细胞的副作用不同。5ALA本身不具备光敏性，在一系列酶的作用下能生成具有强光敏作用的原卟啉Ⅸ(PpⅨ)， 不同的细胞对于5ALAPDT的敏感性不同[67]。为研究5ALAPDT对卵巢癌3AO细胞的杀伤作用，本实验选取不同的光敏剂浓度与不同的激光能量密度进行排列组合。抑制率曲线显示，细胞的抑制率并未随着光敏剂浓度的升高和激光能量密度的增大呈线性增长。当5ALA>2.0mmol/L时，在相同激光能量密度照射下， PDT效应达平台期,此时再增加光敏剂浓度也无益于疗效的显著提高,反而因组织内光敏剂浓度过高而带来光毒性等不良反应。在相同的光敏剂浓度下，随着激光能量密度的增加，细胞增殖抑制率也并未随着激光能量密度的成倍增高而倍增。因此，为保证疗效，避免不必要的副反应，应根据不同类型细胞对光动力的敏感性选择适合的PDT参数。本实验结果提示，激光能量密度为10.0J/cm2、5ALA 浓度为1.0～2.0mmol/L，5ALAPDT对体外培养的人卵巢癌3AO细胞杀伤效应最明显。该结果可供临床参考。

　　有研究表明，PDT可通过阻滞细胞于G0/G1期来抑制细胞增殖[89]。本实验细胞周期分析结果显示, 随着5ALAPDT后作用时间的延长，G0/G1期阻滞比例增高，24h达到高峰为78.89%，5ALAPDT 使3AO细胞生长停顿在G0/G1期，对细胞的增殖有明显抑制作用。有研究表明，在PDT治疗时凋亡是肿瘤细胞死亡的主要原因[10]。光动力治疗后6h，荧光显微镜下观察到细胞核浓集，边聚，有明显的凋亡小体。流式细胞仪结果显示，5ALAPDT可以显著诱导3AO细胞凋亡，5ALAPDT作用后24h，1.0mmol/L和2.0mmol/L的5ALAPDT组的晚期凋亡率增高非常显著，高达(69.34±3.98)% 和(78.59±2.92)%;我们还发现了较高比例的继发性坏死，分别为(15.46±2.12)%和(18.62±1.42)%。继发性坏死的发生可能与较高的5ALA浓度对卵巢癌细胞的作用有关，具体原因还需进一步深入探讨。由此可见, 细胞凋亡是5ALAPDT介导卵巢癌细胞死亡的主要途径,坏死也是其可能的途径。

　　综上所述，5ALAPDT对卵巢癌3AO细胞增殖有明显的抑制作用，可通过阻滞细胞于G0/G1期、诱导凋亡、引发坏死实现其杀伤作用。本研究为临床应用5ALAPDT治疗卵巢癌提供了实验依据。

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