紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞的体外杀伤作用

　　作者：朱丽红，魏丽惠，李小平，赵丽君　刘宁 作者单位：1. 北京大学人民医院妇科，北京 100044;2. 陕西中医学院临床医学院，陕西咸阳 712046

　　【摘要】 目的 探讨注射用紫杉醇脂质体对人子宫内膜癌细胞系的体外杀伤作用。方法 以不同浓度含紫杉醇脂质体的培养基作用于人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞，并设对照(普通培养基)，通过MTT、倒置显微镜观察细胞增殖状况及形态，流式细胞分析技术检测该药对细胞生长的影响。结果 经不同浓度紫杉醇脂质体作用24～96h，细胞存活率显著下降(P<0.05);镜下观察显示部分细胞皱缩变形，崩解坏死，细胞脱壁悬浮;流式细胞术结果显示细胞凋亡率逐渐增加，细胞周期各时相中，S期比例减少。结论 紫杉醇脂质体可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的生长。

　　【关键词】 紫杉醇;脂质体;子宫内膜癌;Ishikawa细胞系;杀伤作用

　　on endometrial carcinoma Ishikawa cell line in vitroZHU Lihong1,2, WEI Lihui1, LI Xiaoping1, ZHAO Lijun1, LIU Ning1

　　(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Peoples Hospital of

　　Peking University, Beijing 100044; 2. Department of Clinical Medicine,

　　Shaanxi College of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)ABSTRACT: Objective To investigate the killing effect of liposome encapsulated paclitaxel on endometrial carcinoma Ishikawa cells in vitro. Methods The human endometrial carcinoma Ishikawa cell line was cultured with different concentrations of the liquid form of liposome encapsulated paclitaxel. MTT assay, inverted microscopic observation and flow cytometry assay (FCM) were then used to monitor the growth and proliferation of the cell line. Results When treated with different concentrations of liposome encapsulated paclitaxel for 24 to 96 hours, Ishikawa cells survival rate decreased significantly (P<0.05); degeneration and necrosis of Ishikawa cells were found under microscope. The rate of cell apoptosis was increased and the rate of S phase was reduced. Conclusion Liposome encapsulated paclitaxel can inhibit endometrial carcinoma cells.

　　KEY WORDS: paclitaxel; liposome; endometrial carcinoma; Ishikawa cell line; killing effect

　　紫杉醇(paclitaxel)是一种存在于紫杉烷类植物树皮和枝叶中的二萜烯类物质，能够稳定细胞微管阻止细胞分裂而抑制癌细胞生长。临床研究表明，紫杉醇对多种实体肿瘤疗效显著。但其水溶性差，聚氧乙基代蓖麻油和无水乙醇组成的混合溶媒会引起组胺的释放，易导致严重的过敏反应[1]。脂质体作为一种新型的药物载体，具有靶向性和缓释性，可提高疗效，降低毒性[2]，是目前研究的热点。本研究探讨紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞系的体外杀伤作用，为临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 癌细胞株 Ishikawa细胞株系北京大学人民医院妇产科实验室保存并传代培养。

　　1.2 药物与试剂 注射用紫杉醇脂质体(商品名：力扑素，南京思科药业有限公司)，30mg/瓶，国药准字H20030357，用10mL 50g/L葡萄糖注射液稀释，专用震荡器振摇5min后使用。DMEM高糖细胞培养基为Hyclone生物化学制品，产品标准号：Q/SY HKL001。胎牛血清(PAA细胞公司)。胰蛋白酶、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT, Sigma)。Annexin VFITC凋亡检测试剂盒(北京大学人类疾病基因研究中心)。

　　1.3 细胞培养 选用雌激素受体阳性的人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞，于含100mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在恒温培养箱(Heraeus)中以50mL/L CO2 、37℃及饱和湿度条件下传代培养。设对照组(普通培养基)、紫杉醇脂质体0.01μmol/L组、0.1μmol/L组、1μmol/L组、10μmol/L组和100μmol/L组。

　　1.4 MTT检测 取进入对数生长期的细胞，以3×105/L接种于96孔培养板中，每组设8个平行孔。细胞铺板培养24h贴壁后，每孔加入150μL相应浓度的含药培养基，24、48、72、96h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h，吸弃孔内培养基，每孔加入100μL盐酸异丙醇(浓盐酸与异丙醇的体积比为1∶250)，震荡摇匀10min，室温静置20min后，在酶联免疫检测仪(BilRad Model 550)上选择570nm波长测定各孔吸光度(A)值，并计算细胞存活率，即：细胞存活率=实验组平均A值/对照组平均A值×100%。重复上述实验3次，取其均值。

　　1.5 倒置显微镜下观察细胞形态 应用IX71141型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)分别观察对照组及紫杉醇脂质体各组作用Ishikawa细胞24、48h的细胞形态。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化 各组培养48h，分别以2.5g/L胰酶消化收集细胞106个，冷PBS冲洗2次，收集并离心弃上清，细胞各分两管分别检测细胞凋亡和细胞周期。检测细胞凋亡管分别加入200μL Binding Buffer和FITC标记的Annexin V(20μg/mL)10μL/管，避光反应30min，再加PI(50μg/mL)4μL，避光反应5min，补齐Binding Buffer至500μL，立即(一般不超过1h)进行流式细胞术检测细胞凋亡。检测细胞周期管分别加入800mL/L冷乙醇固定，4℃过夜，冷PBS冲洗，离心弃上清，加300μL PBS，10mg/mL的Rnase A溶液15μL混匀，37℃孵育30min，加1mg/mL的PI染液混匀，暗室中放置30min后，转入流式管以FACSort流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)进行荧光检测，ModFit LT软件分析细胞周期各时相的特点。重复上述实验2次，取其均值。

　　1.8 统计学处理 使用SPSS13.0统计软件包处理，数据用±s表示，进行重复测量的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞的生长抑制作用 MTT法检测结果显示：不同浓度的紫杉醇脂质体作用Ishikawa细胞24～96h，相同药物浓度下，随着作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低(P<0.05，图1);相同作用时间下，随着药物浓度的升高，细胞存活率逐渐降低(P<0.05，图2)。提示紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞有抑制和杀伤作用，并呈浓度和时间依赖性。

　　2.2 倒置显微镜下观察紫杉醇脂质体作用24、48h Ishikawa细胞形态学变化 对照组的Ishikawa细胞胞质透亮，细胞形态规则，呈细长多边形，贴壁良好，排列紧密，呈对数生长。不同浓度紫杉醇脂质体作用后，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞固缩，胞质减少，形态轮廓不清晰，部分细胞核膜消失，细胞皱缩变圆，崩解坏死，碎片增加，细胞核碎裂，细胞脱壁至悬浮状态。紫杉醇脂质体作用Ishikawa细胞48h，可见到凋亡细胞，随着药物浓度的增加，从1μmol/L浓度起，白色的脂质体沉积逐渐明显(图3)。

　　2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化 紫杉醇脂质体作用Ishikawa细胞48h，细胞凋亡情况及细胞周期变化见图4和图5。结果显示细胞凋亡率显著增加(P<0.05);S期细胞所占比例减少。提示紫杉醇脂质体可抑制Ishikawa细胞增殖(表1)。

　　3 讨 论

　　紫杉醇是一种具有独特结构和独特作用机制的高效、广谱、天然抗肿瘤药，对乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤疗效显著。但其溶解度差，临床使用前的常规预处理也无法杜绝溶媒引起的过敏反应。注射用紫杉醇脂质体以磷脂、胆固醇等为膜材料，采用特殊工艺将紫杉醇包被在脂质体中，不再使用混合溶媒，避免了溶媒引起的毒副反应。

　　子宫内膜癌是妇科三大恶性肿瘤之一，可分为两种亚型[3]，Ⅰ型为雌激素受体阳性，组织类型多为子宫内膜样癌，分化较好。Ⅱ型与高雌激素无关，肿瘤分化差，通常为非子宫内膜样癌。子宫内膜癌的治疗包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗等。文献报道紫杉醇可用于晚期内膜癌患者[4]，但关于紫杉醇脂质体的应用目前尚无报道。本实验以雌激素受体阳性的子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞为研究对象，MTT法检测证实在紫杉醇脂质体的作用下，子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖能力明显受到抑制，且存在时效和量效关系。倒置显微镜观察发现，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，肿瘤细胞变形皱缩、崩解坏死、脱壁悬浮，并有细胞凋亡产生，表明该药对肿瘤细胞生长有抑制作用。流式细胞术检测显示，与对照组相比，用药后的各组细胞凋亡率显著增加，S期细胞所占比例减少，说明在实验药物作用下，肿瘤细胞的DNA合成复制受到抑制，细胞增殖分裂减慢。

　　目前已知，紫杉醇类药物能够促进微管蛋白装配成微管，抑制微管的解聚，使纺锤体失去正常功能，抑制细胞有丝分裂，导致细胞死亡，从而抑制肿瘤细胞增殖[6]。研究还发现，紫杉醇抗肿瘤作用的机制除了与抗微管作用有关外，还与诱发细胞凋亡有关[6]。本实验对Ishikawa细胞的形态学观察和流式细胞术的检测结果亦证实了这一点，并与文献报道结果一致。

　　因此，本实验从细胞生物学水平证实了紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞系的体外杀伤作用，但其影响细胞信号转导等机制有待进一步深入研究。

　　【参考文献】

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　　[2]黄义昆. 脂质体作为药物载体的研究进展 [J]. 中国药师, 2005, 8(7):549550.

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　　[4]DUSKA LR, BERKOWITZ R, MATULONIS U, et al. A pilot trial of TAC (paclitaxe, doxorubicin, and carboplatin) chemotherapy with filgastrim support followed by radiotherapy in patients with highrisk endometrial cancer [J]. Gynecol Oncol, 2005, 96(1):198203.

　　[5]武文红，王光哲. 体外观察紫杉醇对人胆管癌细胞QBC939凋亡的诱导作用 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2005, 26(3):265.

　　[6]陈丽荣，郑树，Willingham MC，等. 紫杉醇诱发人乳癌细胞凋亡的机制研究 [J]. 中华肿瘤杂志, 1997, 19(2):103.