TNFα基因863位点单核苷酸多态性与宫颈癌以及HPV感染的关系

　　作者：尉春艳，吴静，张熙，张菊，高艳娥 作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院妇产科，陕西西安 710004;2. 西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061;3. 第四军医大学基因诊断技术研究所，陕西西安 710033

　　【摘要】 目的 探讨TNFα基因863位点的单核苷酸多态性与宫颈癌以及HPV感染的关系。方法 采用模板介导的染料终止物掺入荧光偏振检测(TDIFP)的方法对59例宫颈癌以及22例对照进行TNFα基因863位点的单核苷酸多态性检测。结果 宫颈癌组的TNFα基因863位点A等位基因频率(39.0%)较对照组(14.6%)明显升高(P<0.01，OR=2.673，95% CI：1.300～5.497);AA基因型在宫颈癌组和对照组中分别为15.3%和0，差异显著(P<0.05);CA基因型在两组中分别为47.5%和29.2%，差异显著(P<0.05);A等位基因频率在HPV阳性者与HPV阴性者之间没有显著性差异(P>0.05，OR=1.950，95% CI：0.840～4.527)，但是在HPV阳性者中具有增高趋势(37.5%)，高于HPV阴性者(19.2%)。结论 TNFα基因863位点A等位基因以及CA、AA基因型与宫颈癌的危险性升高有关，与HPV感染危险性无关。

　　【关键词】 肿瘤坏死因子α;宫颈肿瘤;人乳头瘤病毒;单核苷酸多态性;荧光偏振

　　gene with cervical cancer and HPV infectionWEI Chunyan1, WU Jing1, ZHANG Xi2, ZHANG Ju3, GAO Yane1

　　(1. Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Neurosurgery,

　　the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;

　　3. Institute of Gene Diagnosis, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China)ABSTRACT: Objective To analyze the relationship between cervical cancer, and the polymorphism of tumor necrosis factor α (TNFα) gene at the site of 863. Methods TDIFP was adopted to detect the polymorphism of TNFα gene at the site of 863 in 59 cases and 22 controls. Results The positive rate of A allele at 863 in group of cervical cancer (39.0%) was significantly higher than that in control group (14.6%) (P<0.01, OR=2.673, 95% CI: 1.300～5.497). Genotypes of CA and AA were 47.5% and 15.3% in cases of cervical cancer, and significantly low rates of 29.2% and 0% in cases of control, respectively (P<0.05). Although no significant difference (P>0.05, OR=1.950, 95% CI: 0.840～4.527) was found between HPV positive and negative groups, a trend of high positive rate of A allele at 863 in HPV positive group was found. Conclusion The A allele, AA genotypes and CA genotypes at 863 of TNFα gene is associated significantly with increased risk of cervical cancer. Polymorphism at 863 does not attribute to HPV infection.

　　KEY WORDS: tumor necrosis factor α(TNFα); cervix neoplasm;human papillomavirus; single nucleotide polymorphism;fluorescence polarization

　　宫颈癌是女性生殖系统最为常见的恶性肿瘤之一。世界卫生组织已经于1996年确认高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌的主要病因，在90%的宫颈浸润癌中能够检测到HPV DNA的存在[1]。但是，70%以上的HPV感染具有一过性，可以被机体免疫清除。HPV感染的持续存在与宫颈癌发生的危险性增高有关[2]。因此，有效的免疫环境能够监视并清除HPV感染，减少宫颈癌的发生。

　　肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNFα)是一种具有多种生物活性的细胞因子，在病毒的免疫清除中具有重要作用[3]。研究发现宫颈癌患者的宫颈阴道冲洗液中TNFα的含量升高[4]，在转染HPV的细胞株中可以检测到TNFα的释放并且发现这些细胞的生长受到抑制[5]。TNFα基因的多态性能够影响TNFα基因的转录，影响TNFα的产生和活性，可能与宫颈癌的易感性有关。本实验采用TDIFP的方法研究探讨了TNFα基因863位点的单核苷酸多态性与宫颈癌以及HPV感染的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织标本 宫颈癌59例(平均年龄46.7±9.8岁)，主要来源于西安交通大学医学院第一、二附属医院、陕西省肿瘤医院妇科就诊患者，临床分期采用国际妇产科联盟(FIGO，2000年)标准，其中原位癌8例、Ⅰ期14例、Ⅱ期27例、Ⅲ～Ⅳ期10例。诊断均以术后病理检查结果为准，未行手术治疗者参照活检后的病理检查结果。对照组24例(平均年龄42.7±7.2岁)，包括11例宫颈炎和13例正常宫颈者，宫颈炎标本来源于西安交通大学医学院第二附属医院妇科门诊，均经过临床确诊且巴氏涂片检查未见癌变迹象;正常宫颈组织来源于因非恶性肿瘤原因行子宫全切而且术后病理检查确诊无宫颈癌变的宫颈组织。

　　1.2 主要试剂、仪器 Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶(大连TaKaRa公司);Wizard PCR Preps DNA Purification System、pGEMT Easy Vector System Ⅰ(美国Promega公司);GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit(美国Sigma公司);DH5α菌株(第四军医大学全军基因诊断研究所提供);96微孔板(美国MJ Research公司);PCR扩增仪、荧光偏振检测仪、荧光偏振检测试剂盒(美国PerkinElmer公司)。根据GenBank收录的TNFα基因序列设计包含TNFα863位点的引物和TDI探针，扩增片段长171bp，P1：5′TGTGACCACAGCAATGGGTAGGAGA3′，P2：5′CCCAGTGTGTGGCCATATCTTCTTA3′，TDI探针：5′TCGAGTATGGGGACCCCC3′，由上海生工生物技术有限公司合成。

　　1.3 阳性对照的建立 用酚/氯仿法粗提DNA并以此为模板，进行PCR基因扩增(上、下游引物各1.0μL，5.0μL模板DNA，0.5μL Taq聚合酶，1.5μL dNTPs，2.5μL MgCl2，2.5μL 10×Buffer，11.0μL双蒸水;扩增条件：95℃ 5min，94℃ 30s，54℃ 40s，72℃ 30s，总共35个循环，72℃ 10min)，取10μL PCR反应产物进行15g/L的琼脂糖凝胶电泳，切胶并称重，参照Wizard PCR Preps DNA Purification System核酸纯化试剂盒说明书回收DNA片段。取3.0μL回收产物，1.0μL pGEMT载体，1.0μL T4DNA连接酶，2×T4连接酶缓冲液5.0μL，参照pGEMT Easy Vector System Ⅰ试剂盒说明书进行连接反应。将5.0μL的连接产物加入100μL的DH5α感受态细菌，培养过夜后，连续收集共10mL菌液的菌体，参照GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA，由上海生工生物技术有限公司测序鉴定。

　　1.4 TDIFP法检测863位点的多态性 59例宫颈癌新鲜组织块和22例宫颈炎患者宫颈管分泌物初步处理后，PCR基因扩增(反应体系、条件同阳性对照建立中的PCR)，取反应产物15.0μL，加入以1∶9的比例混合PCR Cleanup Reagent和PCR Cleanup Dilution Buffer 6.0μL，吹打混匀，37℃水浴2h后95℃ 4h，以消化PCR反应中剩余的引物和dNTPs;将消化后的产物按照每管7.0μL分装于两个干净微量离心管中，分别加入已配好的掺入反应混合物(0.5μL点突变检测探针，1.5μL Acyclopol Terminator MIX，0.05μL Acyclopol聚合酶，2.0μL 10×Buffer，8.95μL去离子水)各13.0μL，95℃变性2min，94℃ 15s，49℃ 30s，53℃ 30s，总共30个循环，15℃延伸10min，以掺入检测点突变的探针;将掺入产物10μL加入96孔微孔板，置于荧光偏振检测仪Victor Multi Label Counter中进行FP检测。利用荧光偏振分析软件SNP Macro Victor 384 v4.0来分析检测结果。

　　1.5 TDIFP法检测HPV及型别 GP5+/6+通用引物[6]PCR扩增反应后，利用HPV16/18型特异检测探针，参照TDIFP试剂盒说明书进行消化以及掺入反应，具体方法同1.4，扩增条件改为95℃变性2min，95℃ 30s，45℃ 40s，总共30个循环。

　　1.6 统计学处理以及遗传平衡检验 利用SPSS11.5进行χ2检验，利用拟合优度χ2检验的方法检验基因型频率是否符合Hardy Weinberg遗传平衡定律。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PCR扩增以及多态性检测 以宫颈癌组织和宫颈炎分泌物中提取的DNA为模板，扩增包含863位点的片段，长度应为171bp。电泳后见一清晰条带，长度与预期结果相符(图1)。提取的质粒测序结果显示重组质粒中有包含863位点的目的序列，序列长度与预先设计的相同(171bp)，且与GenBank发表的已知序列同源。以此序列对应的模板DNA作为阳性对照，对TNFα基因863位点进行多态性检测，共检测到两个等位基因C、A，3个基因型：CC、CA、AA。各基因型的检测结果示例见图2～图4(AA为高TAMRA、低R110;CA为高TAMRA、高R110;CC为低TAMRA、高R110;对照：低TAMRA、低R110)。

　　2.2 Hardy Weinberg遗传平衡检验 TNFα基因863位点等位基因频率已达遗传平衡，说明本实验研究资料具有较好的人群代表性。

　　2.3 TNFα基因863位点多态性与宫颈癌的关系 TNFα基因863位点各基因型的分布在宫颈癌和对照组之间有显著性差异(P<0.05)，两个等位基因C和A在两组之间也有显著性差异(P<0.01，OR=2.67，95% CI：1.30～5.50)(表1)。表1 TNFα基因863位点多态性在宫颈癌和对照组中的分布

　　2.4 TNFα基因863位点多态性与宫颈癌分期的关系 TNFα基因863位点各基因型的分布在不同宫颈癌分期之间没有显著性差异(P>0.05)。各等位基因的分布在不同宫颈癌分期之间也没有显著性差异(P>0.05，OR=1.054，95% CI：0.628～1.770)(表2)。

　　2.5 TNFα基因863位点多态性与HPV感染的关系 所有病例中随机抽取49例参与检测HPV感染，其中HPV阳性者36例，阴性者13例。HPV感染与TNFα基因863位点的多态性未见明显相关性(P>0.05，OR=1.950，95% CI：0.840～4.527)，但是863A在HPV感染组具有较高的阳性率趋势(表3)。表2 TNFα基因863位点多态性在不同宫颈癌分期中的分布表3 TNFα基因863位点多态性在HPV感染组和对照组中的分布

　　3 讨 论

　　编码TNFα的基因位于人类染色体的6q21，TNFα基因的单核苷酸多态性与宫颈癌的关系已涉及多个位点，如238、244、163、376和308等，其中238位点与宫颈癌的危险性关联比较大[79]。TNFα基因863位点的单核苷酸多态性与其他疾病的相关性被广泛研究[1012]，而与宫颈癌的关系目前还未见有相关的研究报道。本实验中：TNFα基因863A等位基因以及与A等位基因有关的两个基因型CA和AA在宫颈癌组中的阳性率远远高于对照组，因此863位点A等位基因以及CA、AA基因型可能与宫颈癌危险性升高有关。有研究发现：863位点A等位基因能够使TNFα的表达增加3～4倍[13]，同时另有研究发现，TNFα在宫颈癌患者中的表达显著增加[14]，与本实验结论基本一致。

　　UDALOVA等[13]对TNFα基因863位点A等位基因与疾病之间具有相关性的机制进行了研究，发现863A促进TNFα基因的转录可能与核转录因子NFκB有关。NFκB与基因的相应位置结合形成转录复合物，能够提高基因的转录效率。NFκB通常有两种形式：同源二聚体p50p50和异源二聚体p65p50，其中65ku的蛋白亚基p65能够与DNA链结合，而50ku的蛋白亚基p50抑制这一结合作用，因而p50p50能够抑制转录活性。TNFα基因873至863之间10个碱基的序列与p50p50具有3个不匹配的碱基，863位点C被A代替以后，不匹配的碱基数增加至4个，因而863位点A等位基因与p50p50的结合力比863C与之结合的能力下降了10倍以上。因此，863A等位基因间接地促进了TNFα基因的转录。

　　HPV感染仅仅是宫颈癌的致病高危因素之一，宫颈癌的发病与局部微环境的改变之间的关系亦不可忽视。从高危型HPV感染至宫颈癌的发生需要一个长期的过程，有研究认为平均需要15年左右[13]。在这个长期的过程中，HPV感染的持续状态、慢性炎症环境以及宫颈局部免疫功能的变化与宫颈癌发病的关系更为密切。因此，TNFα基因863位点A等位基因可能通过影响宫颈局部的免疫状态进而影响了HPV感染后的转归，导致HPV感染持续化，增加了宫颈癌的危险性。同时，TNFα基因863位点的多态性与HPV感染之间未见明显相关性，如果将研究范围扩展至多态性与HPV感染的长期性之间的关联，可能会有进一步的发现。

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