葡萄胎组织MMPs与TIMPs表达及意义

　　作者：王灵芝 戴淑真 罗兵 作者单位：青岛大学医学院附属医院妇科，山东 青岛 266003

　　【关键词】 基质金属蛋白酶类 基质金属蛋白酶组织物抑制物 葡萄胎

　　EXPRESSION OF MMPs AND TIMPs IN HYDATIDIFORM MOLE AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE WANG LINGZHI, DAI SHUZHEN, LUO BING (Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical Collage, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo explore the expressions of MMPs and TIMPs in hydatidiform mole and their clinical significance.MethodsThe mRNA expressions of MMPs and TIMPs were detected by RTPCR in tissue of hydatidiform mole (n=35) including six malignant transformed mole and normal villi (n=18).ResultsThe ratios of MMP9/TIMP1 mRNA expressions were significantly higher in the malignant transformed mole than those in the nonmalignant one and normal villi(F=3.62,q=3.82,3.57,P<0.05). The differences in expressions of MMPs and TIMPs were not significant in all cases (P>0.05). Positive correlation between MMP7 and MMP9 expression was noted (r=0.985,P<0.01).ConclusionIt is certain that the ratios of MMP9/TIMP1 mRNA expression plays a role in predicting malignancy of hydatidiform mole.

　　[KEY WORDS]matrix metalloproteinases; tissue inhibitor of matrixnetalloproteinases; hydatidiform mole

　　葡萄胎属于良性肿瘤，但是它具有潜在恶变的性能，虽然长期备受学者们的关注，但目前为止仍无理想的预测恶变的方法。虽然血绒毛膜促性腺激素(HCG)可作为一种较敏感的标志物用于预测葡萄胎的恶变，但是它有一定的滞后性。而基质金属蛋白酶(MMPs)几乎可降解细胞外基质(ECM)中除多糖以外的所有成分,是调节ECM动态平衡的最重要的一大酶系。基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs) 能与相应的MMPs 酶原及其活化形式结合,从而抑制MMPs的活性及产生,阻止肿瘤发生恶变和转移，因此，TIMPs的调节失衡在肿瘤的侵袭及转移中可能起重要作用。本研究通过检测基质金属蛋白酶及其抑制物MMP7、MMP9、TIMP1及TIMP2 mRNA在正常绒毛和葡萄胎组织中的表达水平，探讨它们与葡萄胎恶变间的关系，为临床治疗提供依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　35例葡萄胎病例均为2001年1月～2003年1月在青岛大学医学院附属医院住院病人，经病理检查诊断为葡萄胎，清宫前均未进行预防性化疗;病人年龄22～36岁，中位年龄28岁;平均孕周为12周;随访期间有6例恶变为侵蚀性葡萄胎，其诊断参照宋鸿钊[1]提出的侵蚀性葡萄胎的诊断标准，列为葡萄胎恶变组(A组)，其余病人作为萄胎未恶变葡组(B组)。18例行人工流产健康妇女作为对照组，随访后未发生滋养细胞疾病或持续性血HCG升高;病人年龄23～36岁， 中位年龄28岁;平均孕周为12周。

　　1.2 方法

　　1.2.1 新鲜标本的收集与处理 所有标本均在清宫时收集，取宫腔小水泡组织约0.5 g，置于 1.5 mL DEPC处理EP管中，立即置-79 ℃冰箱中备用。

　　1.2.2 RTPCR方法 所有引物均由上海生工生物有限公司合成，以GAPDH为内参照。组织样本匀浆破碎后，按照Trizol(Invitrogen公司)说明提取总RNA，用紫外分光光度计测定RNA样品于波长260和280 nm处的吸光度，以观察所提取RNA样品的纯度，并计算其含量;取1 g总RNA按照PromegaA3500逆转录试剂盒说明合成cDNA;取3 μL 逆转录产物，2.5 μL buffer,1.5 μL MgCl2,0.5 μL dNTP,上下游引物各1.25 μL，Taq酶0.2 μL，最后加入去离子水至25 μL。开始94 ℃变性5 min，然后94 ℃预变性30 s;MMP9、MMP7、TIMP1及TIMP2分别行54、57、53、57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存;取5 μL PCR产物，1 μL上样缓冲液于20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳60 min，在紫外线下凝胶成像。

　　1.2.3 表达结果判断标准 PCR产物半定量分析,用天能GIS凝胶图像分析系统扫描凝胶，进行吸光度扫描和测定灰度值。以GAPDH 作为内参照校正, 用目的基因与GAPDH灰度比值作为目的基因的相对表达含量。

　　2 结 果

　　2.1 MMPs与TIMPs mRNA在各组织中的表达

　　2.1.1 RNA样品鉴定 所提标本的RNA浓度在0.5～5.0 g/L之间，A260/A280在1.8～2.0之间，20 g/L的琼脂糖凝胶电泳RNA可见3条清晰的条带(图1～4)。

　　2.1.2 MMPs与TIMPs mRNA在各组织中的相对表达 各组MMP9、MMP7、TIMP1、TIMP2的mRNA表达水平差异无显著意义(P>0.05)。MMP9/TIMP1比值在各组中的表达差异有显著性(F=3.62，P<0.05);A组中MMP9/TIMP1比值分别高于B组和对照组，差异有显著意义(q=3.82、3.57,P<0.05)。表1 各组组织中 MMPs与TIMPs mRNA的相对表达水平

　　2.2 各指标间的相关性分析

　　经Pearson相关性分析显示，在所有组织中MMP9与MMP7表达呈正相关(r=0.985,P<0.01)，MMP9与TIMP1表达也呈正相关(r=0.616,P<0.01)。

　　3 讨 论

　　预测葡萄胎是否恶变是葡萄胎治疗中一个极为重要的问题，此问题长期以来备受学者们的关注，此方面的研究也不少，但仍无理想的预测恶变的方法。目前临床上普遍将年龄大于40岁，清宫前子宫大于正常妊娠月份，卵巢黄素化囊肿直径大于6 cm,清宫前血HCG>100 kU/L列为葡萄胎恶变的高危因素[2]，但不是惟一因素。当存在上述恶变高危因素时，葡萄胎易发生恶变，但由于准确性不高，影响到对预防性化疗的评价。研究表明，滋养细胞和肿瘤细胞的侵入过程具有相似性，葡萄胎恶变为侵蚀性葡萄胎的过程中，必须多次溶解血管内皮基底膜，其中MMPs和TIMPs动态平衡失调在此过程中可能起到了非常重要的作用。已有学者研究了MMPs和TIMPs在子宫内膜异位症发生发展中的作用，结果显示，MMP1/TIMP1比例失衡使异位内膜组织具有更强的侵袭能力，可能在该病的发生发展中起重要作用[3]。

　　本文研究结果显示，MMP9、MMP7、TIMP1、TIMP2在各组中的表达均无显著性差异，这可能是因为正常孕早期绒毛组织也可分泌MMPs,分解子宫内膜基底膜,有利于胚泡植入和胎盘形成,同时又受到TIMPs在时间和空间上的严格限制;良性葡萄胎是局限在宫腔内，并非浸润，与正常绒毛侵蚀子宫内膜过程相仿，因此，他们分泌的MMPs与TIMPs无差异性。而侵蚀性葡萄胎关键在于侵蚀，MMPs在其侵蚀过程中起重要作用。本研究结果显示，葡萄胎恶变组的MMPs与TIMPs虽略高于正常绒毛组和葡萄胎未恶变组，但差异无统计学意义。TIMP1是MMP9的特异性抑制因子。本研究结果显示，MMP9与TIMP1呈正相关，说明随着MMP9表达的升高，TIMP1表达也升高，而不是降低。因此，虽然MMPs与TIMPs分别在各组中的表达差异无统计学意义，但MMP9/TIMP1比值在葡萄胎恶变组中的表达明显高于正常绒毛组和葡萄胎未恶变组，差异有显著性,而在正常绒毛组和葡萄胎未恶变组中的表达差异无显著性。因此，可以认为MMPs与TIMPs比例失衡即TIMP1比值升高在葡萄胎的恶变过程中可能起重要作用。

　　MMP7又称基质溶解素。研究表明，MMP7表达量的增高，不仅有助于肿瘤细胞的扩散和转移，还有助于肿瘤血管的形成[4]。由于滋养细胞可以取代血管内皮细胞形成血管内皮层， MMP7在妊娠滋养细胞疾病中的主要作用可能是协助滋养细胞取代血管内皮细胞，参与血道转移。MMP7可以激活MMP9，许多学者联合这两个指标来检测他们在肿瘤细胞中的表达及其意义。TANIOKA等[5]研究MMP7、MMP9与早期食管癌预后的相关性显示，MMP7的表达主要与淋巴结转移有关，MMP9表达主要与肿瘤浸润深度、淋巴浸润、淋巴结转移和病理分期有关，在出现浸润之前就有MMP7、MMP9的联合表达可能与预后有关。MISUGI等[6]研究了MMPs和TIMPs在子宫内膜癌组织中的表达，显示MMP 7在分级高的肿瘤中比分级低的肿瘤中表达高，在分级高的子宫内膜癌中MMP 7表达升高可能与肿瘤的浸润、转移有关。本研究经相关性分析表明，MMP7表达增多时，MMP9表达也增多，这从基因水平表明了两者呈正相关，且关系密切，在葡萄胎出现恶变之前就有MMP7及MMP9联合表达升高，提示可能是葡萄胎恶变的早期表现。

　　总之，本文通过比较各组中MMPs及TIMPs的mRNA表达水平显示，虽然在有恶变倾向的葡萄胎中的表达均略高于良性葡萄胎和正常绒毛，但差异无显著性;而MMP9/TIMP1比值在葡萄胎恶变组中的表达高于正常绒毛组和葡萄胎未恶变组,因此认为MMP9/TIMP1比值可望作为判断葡萄胎预后的一项参考指标，特别是对葡萄胎有恶变倾向的病人进行预防性化疗可提供理论依据。

　　【参考文献】

　　[1]宋鸿钊. 滋养细胞肿瘤的诊断和治疗[J].北京：人民卫生出版社, 2004：8892.

　　[2]乐杰. 妇产科学[M]. 第6版.北京：人民卫生出版社, 2003:319329.

　　[3]娄艳辉,钱金花,郭新华. MMP1及TIMP1在异位内膜组织中的表达[J]. 齐鲁医学杂志， 2004,19(5):392393.

　　[4]LIU X P, KAWAUCHI S, OGA A, et al. Prognostic significance of matrix metalloproteinase7 (MMP7) expression at the invasive front in gastric carcinoma[J]. Cancer Research, 2002,93(3):291295.

　　[5]TANIOKA Y, YOSHIDA T, YAGAWA T, et al. Matrix metalloproteinase7 and matrix metalloproteinase9 are associated with unfavorable prognosis in superficial oesophageal cancer[J]. Br J Cancer, 2003,89(11):21162121.

　　[6]MISUGI F, SUMI T, OKAMOTO E, et al. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinase in uterine endometrial carcinoma and a correlation between expression of matrix metalloproteinase7 and prognosis[J]. Int J Mol Med, 2005,16(4)：541546.