MMP2、TIMP2及VEGF蛋白在子宫内膜异位症裸鼠模型组织中的表达及意义

　　作者：夏玉芳 作者单位：青岛大学医学院附属医院妇科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 建立裸鼠子宫内膜异位症(EMs)模型，检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP2)、血管内皮生长因子(VEGF)在异位内膜及正常内膜的表达，探讨其在EMs发生、发展中的作用。方法 将育龄妇女正常分泌晚期子宫内膜注入裸鼠盆腹腔，建立EMs裸鼠模型，光镜下观察异位病灶的形态学特点，并采用免疫组化方法(PV6001/6002法)检测异位内膜MMP2、TIMP2、VEGF蛋白表达水平，与种植前子宫内膜比较。结果 光镜下观察，异位病灶具有增生期特点;且异位内膜较正常内膜MMP2/TIMP2比值增高(t=12.919,P<0.01),VEGF蛋白表达增强(t=2.647,P<0.05)。结论 裸鼠模型是EMs早期临床研究的理想模型;MMP2/TIMP2比值升高及VEGF表达增强与异位内膜的高侵袭性和高血管新生能力有关，在EMs的发生发展中起重要作用。

　　【关键词】 子宫内膜异位症 小鼠 基质金属蛋白酶2 金属蛋白酶组织抑制因子2 血管内皮生长因子 免疫组织化学

　　THE EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEINASE 2, TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE 2 AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR IN NUDE MOUSE ENDOMETRIOSIS MODELXIA YUFAN， LOU YANHUI， YU YUNPENG， et al(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveBased on the constructed model of nude mouse endometriosis, to detect the expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP2), tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the ectopic endometrial tissues and discuss the role of them in the pathogenesis of endometriosis. MethodsThe model was constructed by injecting endometrial chipping at late secretory satge of childbearing age woman into the peritoneal cavity of experimental animals killed at 18 d after the injection. The expressions of MMP2, TIMP2 and VEGF in the grafts were detected by immunohistochemical method. ResultsThe characteristics of proliferative stage were observed in ectopic focus, the ratio of endometrial MMP2/TIMP2 was higher, and VEGF expression enhanced. ConclusionThe nude mouse model is an ideal model for the study of early phase of endometriosis. The increase of MMP2/TIMP2 ratio and VEGF expression are related to high invasion and angiogenesis of endometriosis, which plays an important role in the occurrence and development of the disease.

　　[KEY WORDS]endometriosis; mouse; matrix metalloproteinase2; tissue inhibitor of metalloproteinase2; vascual endothelial growth factor

　　子宫内膜异位症(EMs)是指子宫内膜的间质细胞和腺上皮细胞在宫腔以外的部位异常生长,是育龄妇女常见非肿瘤性疾病，发病率逐年升高。其发病机制不明，目前以SAMPSON的种植学说为主导理论。但近年研究认为, 经血逆流仅是EMs发病的诱因，而脱落内膜细胞的生理机制改变，如黏附性、侵袭性增强和血管形成才是引起EMs的主要原因[1]。基质金属蛋白酶2(MMP2)及其组织抑制因子2(TIMP2)、血管内皮生长因子(VEGF)正是与此相关的重要因子。本研究通过建立EMs裸鼠模型，检测MMP2、TIMP2及VEGF蛋白在异位内膜组织中的表达，探讨MMP2、TIMP2、VEGF在EMs发生发展中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 人子宫内膜标本来源及处理

　　标本取自2006年2～4月在青岛大学医学院附属医院因妇科良性病变(非EMs、子宫内膜正常)行子宫切除术的病人。病人年龄41～47岁，月经规 律，无内科并发症，术前6个月未用过激素类药物。术中无菌刮取分泌晚期子宫内膜，冷PBS反复漂洗,剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm～1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm碎块,置入Dhanks液中(加入青霉素、链霉素各2×105 U/L)。术后病理证实子宫内膜正常。取材后1 h内接种。

　　1.2 实验动物

　　雌性裸鼠nu/nu(纯合子)30只，6～10周龄，体质量为20～25 g，购自上海斯莱克动物实验中心。SPF级条件饲养。

　　1.3 模型建立及移植物处理

　　裸鼠行腹腔麻醉(100 g/L水合氯醛，每20 g体质量0.5 mL)。以7号针头吸取含内膜碎屑的Dhanks液，以腹中线脐下为穿刺点，注入腹腔，每只裸鼠予1 mL(约含子宫内膜碎屑20块)，术后放回笼中饲养。术后肌注青霉素、链霉素3 d预防感染。于术后18 d 处死裸鼠，剖腹观察盆腹腔病灶形成情况，留取异位病灶立即放入100 g/L中性甲醛中固定、石蜡包埋。

　　1.4 免疫组织化学检测及结果判定

　　人上皮膜抗原(EMA)单克隆抗体、兔抗人MMP2多克隆抗体、鼠抗人TIMP2单克隆抗体及兔抗人VEGF单克隆抗体均购自北京中杉公司。3 μm 厚连续切片，一张行苏木精伊红染色，余者采用PV6001/6002二步法行免疫组化染色，染色步骤按说明进行。免疫组化结果用自动图像分析软件进行分析，每张切片保持光线强度不变，随机选择3个视野(400倍)输入计算机进行分析，以平均吸光度值作为MMP2、TIMP2、VEGF的表达强度。

　　1.5 统计学方法

　　采用SPSS 10.0统计软件，对资料进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察

　　本文30只裸鼠接种内膜， 其中23只发现种植内膜成活，成功率为76.7%。大体观察可见种植物[(0.29±0.10) cm]与裸鼠组织呈融合状态，表面有小血管爬行。种植主要发生在盆腹腔的腹壁、肠系膜、肠管和肝表面，腹壁、肠管与网膜的脂肪组织间可有粘连带。

　　2.2 组织学观察

　　镜下种植物呈增生期表现，立方状或扁平的腺上皮细胞围成圆形或椭圆形腺腔，周围是有大量炎细胞浸润的间质成分，间质无蜕膜化;种植灶边缘结缔组织增生，可见玻璃样变性;异位内膜同裸鼠组织交界处有丰富的新生毛细血管网。

　　2.3 免疫组化分析

　　2.3.1 EMA的表达 抗人EMA抗体可与人源组织中的上皮细胞特异结合，而与啮齿类动物上皮组织无交叉反应。本实验中，种植物腺上皮细胞呈棕黄色阳性表达，而裸鼠组织阴性表达。

　　2.3.2 MMP2、TIMP2的表达 MMP2、TIMP2为胞浆阳性表达，表达于正常及异位内膜的腺体和间质，以腺体表达明显。异位内膜中可见MMP2蛋白呈棕黄色阳性表达，而TIMP2为弱阳性或阴性表达。

　　正常内膜MMP2蛋白表达量明显低于异位内膜(t=13.442,P<0.01)。而TIMP2蛋白在正常子宫内膜较在异位内膜表达量增高(t=9.107，P<0.01)。正常内膜MMP2/TIMP2值明显低于异位内膜组(t=12.919，P<0.01)。见表1。

　　2.3.3 VEGF的表达 VEGF蛋白亦是胞浆阳性表达。在内膜组织的腺上皮、间质、血管内皮均有着色。在人正常分泌晚期内膜呈弱阳性表达，而异位组织呈棕黄色、黄褐色的阳性表达内膜。正常内膜组织的表达水平低于异位内膜组织(t=2.647,P<0.05)。见表1。表1 正常内膜、异位内膜MMP2、TIMP2及VEGF蛋白表达水平比较

　　3 讨 论

　　3.1 裸鼠EMs模型的建立

　　EMs发病率不断上升，其病因复杂，发病机制不清，理想动物模型的建立对EMs的研究是必要的。nu/nu裸鼠，先天无胸腺， 淋巴免疫缺陷，其种植物的光镜、超微结构、染色体核型均不改变，且保留人类特性，如对药物的敏感性等，故得到广泛应用。本实验将人子宫内膜碎屑注射入裸鼠腹腔，模拟经血逆流过程，获得成活的种植物，切片苏木精伊红染色可见腺体及间质组织，用与啮齿类无交叉反应的人EMA抗体行免疫组化检测呈阳性表达，均证实种植成功。而且裸鼠体内人子宫内膜种植物的形态与人类子宫内膜异位病灶形态极其相似，故 为很好的 EMs 动物模型，适于早期EMs的发病机制及药物作用的研究。

　　实验采用腹腔注射方法，排除了开腹操作及缝合造成的盆腹腔粘连、损伤及炎症反应。种植物镜下有大量炎细胞浸润，说明EMs本身可致炎症反应，亦能造成腹腔粘连，这也是临床上不孕的原因之一。实验中保持了腹膜间皮的完整，而种植物也多出现于非注射部位的腹壁、肠管、肝脏等，这同VAN DER LINDEN等[2]提出的腹膜间皮的不完整造成子宫内膜异位种植的假说相矛盾。

　　3.2 裸鼠异位内膜组织MMP2、TIMP2、VEGF蛋白表达的意义

　　近年来的研究显示，子宫内膜碎片(腺上皮及间质细胞)必须通过黏附、侵袭和血管形成这一过程,方可发生异位种植、生长,并引起病变和症状。在这种类似于恶性肿瘤的侵袭过程中，基质金属蛋白酶(MMPs)起着重要作用。它可以降解细胞外基质(ECM)，促进侵袭及细胞间粘连[3]，而使脱落的子宫内膜细胞发生腹腔种植。MMP2是MMPs家族中的重要因子，可以降解Ⅳ型胶原和明胶，调节细胞间的黏附，促进EMs的发生、发展。而TIMP2则是MMP2的天然抑制剂，可与其1∶1结合而抑制其活性。研究认为，异位内膜的MMPs/TIMPs比值升高，可促使ECM崩解，增强子宫内膜侵袭性，参与EMs的发病[4，5]。本研究的结果与此结论相似，通过建立EMs裸鼠模型，发现MMP2蛋白在异位病灶的表达高于正常内膜，而TIMP2蛋白表达降低，提示异位内膜蛋白水解能力增强，可促进ECM的降解和重建，易于子宫内膜细胞的异位种植和生长，导致异位病灶的形成。

　　VEGF是促血管新生的重要因子，通过与血管内皮细胞的特异受体结合，发挥强大的促内皮细胞增殖、促血管生成作用[6]。在本研究中，异位内膜较正常内膜VEGF蛋白的表达增强，即异位内膜存在更强的血管新生能力，随经血逆流的内膜在与腹膜黏附后，可在腹膜内形成血管网，为其浸润、生长提供血供支持。

　　研究表明，在EMs中，VEGF与MMPs还具有相互促进的作用[7]。MMPs可以降解血管基膜及细胞外基质，调节细胞黏附，在新生血管形成中发挥重要作用;而VEGF则能特异性地促进内皮细胞增殖,并可提高血管的通透性，促进细胞外基质降解;同时，TIMPs通过抑制MMPs的活性，抑制血管生成素诱导的血管内皮细胞出芽生长等, 防止ECM 降解,维持血管的稳定性。它们相互影响,共同参与了EMs的发生、发展。所以，MMPs与TIMPs表达的失平衡及VEGF的过表达可能是导致EMs发生的重要因素,与脱落内膜的侵袭与转移及EMs 的发生、发展都有着密切的关系。但目前有关其作用机制及调节因素尚不明了，还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]WITZ C A, THOMAS M R, MONTOYARODRIGUEZ I A, et al. Shortterm culture of peritoneum explants confirms attachment of endometrium to intact peritoneal mesothelium[J]. Fertil Steril, 2001,75(2):385390.

　　[2]VAN DER LINDEN P J, DE GOEIJ A F, DUNSELMAN G A, et al. Endometrial cell adension in an in vitro model using amniotic membranes[J]. Fertil Steril, 1996,65(1)：7680.

　　[3]UEDA M, YAMASHITA Y, TAKEHARA M, et al. Gene expression of adhension molecules and matrix metalloproteinases in endometriosis[J]. Gynecol Endocrinol, 2002,16(5):391402.

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　　[5]娄艳辉,钱金花,郭新华. MMP1及TIMP1在异位内膜组织中的表达[J]. 齐鲁医学杂志， 2004，19(5)：392393，395.

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　　[7]齐璇,辛晓燕,常吉庆,等. 基质金属蛋白酶2、血管内皮生长因子在子宫内膜异位症中的表达及意义[J]. 肿瘤防治研究， 2003，30(1)：1517.