孕妇血浆胎儿DNA检测及其在产前诊断中的应用

　　作者：王修海 姜晓静 纪向虹 作者单位：青岛大学医学院生物学教研室，山东 青岛 266021

　　【摘要】 目的 检测孕妇血浆中游离胎儿DNA的水平，探讨应用孕妇血浆胎儿DNA进行非损伤性产前基因诊断的可行性。方法 应用血浆DNA抽提法提取63例孕7～40周妇女血浆中胎儿DNA，运用PCR扩增技术对SRY基因和4个短串联重复序列(STR)多态位点(D21S11、D21S1411、D21S1412、D21S1414)进行检测。结果 在33例妊娠男胎的孕妇血浆中，有29例出现SRY基因扩增带，孕早、中、晚期的SRY基因检出率分别是72.7%(8/11)、90.9%(10/11)、100%(11/11)。用4个单一STR多态位点检测出胎儿特异等位基因的比例分别为51/63、49/63、16/63、48/63。联合应用4个多态位点可以确定所有孕妇血浆中的胎儿DNA。结论 在不同的妊娠阶段都可检测到孕妇血浆中的胎儿DNA，胎儿DNA检出率随孕周的增加增高。孕妇血浆中游离胎儿DNA可以用于无创伤产前诊断。

　　【关键词】 胎儿 DNA 产前诊断 聚合酶链反应 串联重复序列

　　DETECTION OF FETAL DNA IN MATERNAL PLASMA AND ITS APPLICATION IN PRENATAL DIAGNOSIS WANG XIUHAI, JIANG XIAOJING, JI XIANGHONG(Department of Biology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo detect the regularity of appearance and disappearance of free fetal DNA in plasma of pregnant women and to explore the possibility of noninvasive prenatal gene diagnosis by using fetal DNA in maternal plasma. Methods The DNA templates were extracted by plasma DNA extraction from 63 gravida (conceived 6-40 weeks) plasma. SRY gene and four short tandem repeats (STRs) (D21S11, D21S1411, D21S1412, D21S1414) of fetal DNA were detected by polymerase chain reaction (PCR). ResultsSRY gene was detected in 29 of 33 malebearing pregnantwomen plasma. The detecting rates of SRY gene were 72.7% (8/11), 90.9% (10/11) and 100% (11/11) at early pregnancy, mediumterm pregnancy, and late pregnancy, respectively. The detecting rates of a fetalspecific band were 51/63, 49/63, 16/63, and 48/63 by means of four single STRs analysis, respectively. The fetal DNA in plasma was identified in all pregnant women by combining with four STRs analysis. ConclusionFetal DNA in maternal plasma can be detected in different gestational stages. The detection rates of fetal DNA in maternal plasma increase with the week of gestation. Fetal DNA in maternal plasma could be regarded as the gene resource for noninvasive prenatal diagnosis.

　　[KEY WORDS]fetus; DNA; prenatal diagnosis; polymerase chain reaction; tandem repeat sequences

　　产前诊断是预防遗传病的重要手段。目前，产前诊断所使用的材料一般是通过羊膜穿刺术等损伤性手段获取,这些方法对母儿有一定的危险性。孕妇外周血中胎儿细胞的发现为非损伤性产前诊断带来希望，但仍存在操作复杂、仪器试剂昂贵、胎儿细胞含量低等一些无法克服的问题，限制了其在临床产前诊断中的应用。1997年有学者发现在母体血浆中存在着游离胎儿DNA[1],这一发现为非损伤性产前诊断开辟了新的途径。本研究以母体血浆中提取的DNA为材料，通过PCR扩增Y染色体上的特异序列检测胎儿DNA的存在及其消长规律,并应用21号染色体的4个短串联重复序列(STR)位点为遗传学标记，检测孕妇外周血浆中的胎儿父源特异性序列,以鉴定女性胎儿DNA的存在。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象

　　选择2002年3～12月在青岛市市立医院、青岛市计划生育研究所就诊的不同孕周(6～40周)孕妇63例，各取外周血2 mL(ACD抗凝)，孕妇年龄24～30岁。其中，孕早期18例，孕中期30例，孕晚期15例。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA提取 按常规分离孕妇外周血浆，血浆中游离基因组DNA的提取按UNIQ10DNA柱式抽提试剂盒说明书进行。

　　1期王修海，姜晓静，纪向虹.孕妇血浆胎儿DNA检测及其在产前诊断中的应用29

　　1.2.2 PCR引物 PCR试剂和DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。引物名称及序列见表1。表1 引物名称及序列

　　1.2.3 孕妇血浆胎儿DNA的SRY基因扩增 采用PCR技术。50 μL反应体系包含：10×Buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)8 μL，引物(109F、245R)各300 nmol/L，4×dNTP(10 mmol/L)200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，样本DNA 5 μL，去离子水20.75 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环;72 ℃延伸10 min。每次扩增均设阳性和阴性对照。

　　1.2.4 孕妇血浆胎儿DNA多态位点的PCR扩增25 μL反应体系内含有：10×Buffer 2.5 μL，4×dNTP(10 mol/L)0.3 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，引物D21S11、D21S1411、D21S1412、D21S1414 F、R(10 μmol/L)各2.0 μL，样本DNA 5 μL，Taq DNA聚合酶1.5 U，去离子水11.4 μL。PCR反应程序：94 ℃ 10 min;94 ℃ 48 s;60 ℃ 48 s，72 ℃ 1 min，40个循环;72 ℃延伸10 min。

　　1.2.5 PCR产物的检测 分别取5 μL PCR产物在60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1;离子强度为1×TBE)中电泳，200 V、25 mA室温下电泳1.5 h。凝胶用硝酸银染色，照相记录。根据电泳条带进行实验结果分析。

　　2 结 果

　　2.1 不同孕周的孕妇外周血浆SRY基因检测

　　胎儿出生后证实63例胎儿中33例为男胎，30例为女胎。在33例男胎妊娠的孕妇外周血浆中检测到SRY基因，不同妊娠时期检出率分别为：孕早期72.7%(8/11)、孕中期90.9%(10/11)、孕晚期100%(11/11)。而在30例女胎妊娠的孕妇外周血浆中未检测到SRY基因。该方法最早可于孕7周检测出该基因，分娩后2 h内检测不到(图1)。

　　2.2 孕妇外周血胎儿DNA各STR位点的多态性检测

　　不同位点可扩增出胎儿特异性等位基因的比例不同。63例中51例在D21S11位点出现结果(孕早期10例，孕中期27例，孕晚期14例);49例在D21S1411位点出现结果(孕早期9例，孕中期26例，孕晚期14例);16例在D21S1412位点出现结果(孕早期2例，孕中期8例，孕晚期6例)。D21S1414位点48例出现结果(孕早期10例，孕中期27例，孕晚期14例)。63例标本经4对引物扩增均可检测到胎儿父源性特异等位基因(图2)。

　　3 讨 论

　　1977年LO等[1]首先报道了在孕妇血浆中存在胎儿DNA。此后又有一些学者通过PCR技术扩增Y特异性DNA序列证明孕妇血浆中胎儿DNA的存在，并对胎儿DNA的含量、检测技术进行了探讨[2～5]。 本研究选择不同孕周的孕妇为研究对象，采用专用柱式血浆DNA抽提方法提取其外周血的胎儿DNA，该方法提高了胎儿DNA的浓度和纯度。通过对胎儿DNA的SRY基因PCR扩增显示，在33例男胎妊娠的孕妇血浆中有29例检测出SRY基因，并且SRY基因的检出率随孕周的增加而增加。说明胎儿DNA在孕早期即出现在母体血循环中，可能随胎儿和胎盘的发育、体积的增长、孕周的增加，胎儿DNA在孕妇血循环的含量升高。这一研究结果与国内外的一些检测结果是一致的[2～5]。由于孕妇血浆中胎儿DNA含量存在个体差异，检出时间略有不同，所以不同的孕期准确度差别较大，孕早期检测结果误差较大，而孕中期的诊断符合率较高。因此，选择孕中期作为采血时间进行胎儿DNA检测及其他遗传学检查比较合适。引起胎儿DNA释放入母血循环的原因还有待阐明，其可能的机制有：①物理和免疫损伤所致细胞溶解;②某种胎儿组织细胞凋亡。

　　由于以Y染色体上的特异序列为检测胎儿DNA的标志，只能对男性胎儿进行检测，而不适用于占50%的女胎妊娠的孕妇。因此，人们尝试通过检测常染色体上的多态位点来突破性别限制，从母体血浆中检测出男性和女性胎儿DNA。自20世纪90年代以来,STR位点已作为一类重要的遗传标记系统应用于法医学个人识别和亲子鉴定。STR位点扩增片段长度等位基因传递符合孟德尔遗传规律，胎儿的一对同源染色体，一条来自母亲，一条来自父亲。胎儿有可能从父亲那里遗传有别于母亲的特异序列。父亲的STR标记如果有别于母亲的两条STR标记则被看成是有信息量的。用PCR扩增孕妇外周血DNA的STR位点时，如果孕妇在该位点表现为不同等位基因的杂合子，则电泳结果出现两条密度较高的条带(密度比相近)和一条密度较低的条带;如果孕妇在该位点表现为相同基因的纯合子，则电泳结果出现一条密度较高的条带和一条密度较低的条带。若孕妇和胎儿在所检测的位点表现为相同的等位基因，则电泳结果不出现密度较低的条带。1999年PERTL等[6]选择常染色体上9个具有高度多态性的STR作为检测对象，采用多重荧光PCR技术从母体血浆提取的DNA中检测到胎儿特异性等位基因;TANG等[7]以X染色体上特异性的STR位点为标记，从母体血浆中检测到胎儿的父源性X染色体的STR位点,成功地从母体血浆中检测出男性和女性胎儿DNA。从母体血浆或血清中提取胎儿DNA的检出率较从母血中富集分离胎儿细胞然后提取细胞核DNA的检出率要高得多。国内贺桂芳等[8]也对胎儿DNA进行了STR基因型的鉴定。本文采用PCR技术结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术，以21号染色体上的4个STR位点作为标志对母体血浆提取的DNA进行检测，也同样检测到胎儿特异性等位基因。该方法简单，有较高的准确率。

　　利用孕妇血浆胎儿DNA进行非侵入性产前诊断是较为理想的方法。目前用孕妇血浆胎儿DNA可以进行胎儿性别、X连锁遗传病、某些常染色体遗传病等的产前诊断，也有人运用定量PCR技术对非整倍体染色体病进行产前诊断[9]。随着分子生物学的发展，对孕妇血浆胎儿DNA的检测有望发展成一种非侵入性产前诊断的新技术。

　　【参考文献】

　　[1]LO Y M D, CORBETTA N, CHAMBERIAN P F, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]. Lancet， 1997，350:485487.

　　[2]SMID M, LAGONA F, DE BENASSUTI L, et al. Evaluation of different approaches for fetal DNA analysis from maternal plasma and nucleated blood cells[J]. Clin Chem, 1999， 45:15701572.

　　[3]LO Y M D, TEIN M S C, LAU T K, et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis[J]. Am J Hum Genet, 1998，62:768775.

　　[4]HOUFFLINDEBARGE V O， DONNELL H, OVERTON T, et al. High sensitivity of fetal DNA in plasma compared to serum and nucleated cells using unnested PCR in maternal blood[J]. Fetal Diagn Ther, 2000，15:102107.

　　[5]蔡胜和，郎铁明，吴东颖，等. 孕妇血浆中胎儿DNA的检测[J]. 基础医学与临床，1999，19(5)：3741.

　　[6]PERTL B, SIKIZAWA A, SAMURA O, et al. Detection of male and female fetal DNA in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats[J]. Hum Genet, 2000，106:4549.

　　[7]TANG N L S, LEUNG T N, ZHANG J, et al. Detection of fetalderived paternally inherited Xchromosome polymorphisms in maternal plasma[J]. Clin Chem, 1999， 45:20332035.

　　[8]贺桂芳，陈汉平，马旭. 孕妇血浆胎儿DNA在产前诊断中的初步应用[J]. 实用妇产科杂志， 2002，18(3)：158160.

　　[9]ZHONG X Y, BURK M R, TROEGER C, et al. Fetal DNA in maternal plasma is elevated in pregnancies with aneuploid fetuses [J]. Prenat Diagn, 2000， 20:795798.