含survivin启动子重组的条件复制腺病毒联合顺铂对卵巢癌株HO-8910体外作用的实验研究

　　作者：张蓓 刘嘉茵 韩素萍 作者单位：徐州市中心医院妇科，江苏徐州221009

　　【摘要】 观察含survivin启动子的条件复制腺病毒CRAd-survivin-RGD4C联合顺铂对卵巢癌细胞株HO-8910的抑制作用。方法 不同浓度的条件复制腺病毒CRAd-survivin-RGD4C病毒、顺铂以及该病毒联合顺铂体外处理人卵巢癌HO-8910细胞，四甲基偶氮唑蓝比色法检测人卵巢癌HO-8910细胞的生长情况，流式细胞技术检测细胞凋亡。 结果 该腺病毒对肿瘤细胞生长具有明显的抑制效应，并有浓度依赖性，联合化疗可以取得更佳的抑制肿瘤细胞生长的效果。结论 溶瘤病毒联合顺铂治疗卵巢癌可能具有良好的前景。

　　【关键词】 卵巢癌 survivin 条件复制腺病毒 基因治疗 联合治疗

　　A novel conditionally replicating adenovirus combined with cisplatin (CDDP)

　　enhanced the antitumorous effect on ovarian cancer cell line

　　ZHANG Bei1, LIU Jiayin2, HAN Suping3

　　(1. Department of Gynecology, Central Hospital of Xuzhou, Xuzhou, Jiangsu 221009, China;

　　2. Department of Gynecology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,

　　Nanjing, Jiangsu 210029)

　　Abstract: Objective To investigate the effect of a novel conditionally replicating adenovirus CRAd-survivin-RGD in combination with cisplatin (CDDP) on ovarian cancer HO-8910 cells. Methods Different doses of the virus CRAd, with or without the combination of CDDP, were used to infect the ovarian cancer HO-8910 cells. The cell viability was determined by MTT assay; the rate of apoptosis, by flow cytometry. Results The CRAd killed HO-8910 cells in a dose-dependant manner. The inhibitory rate was higher in the combination treatment group than in the groups treated with CRAd alone or CDDP alone. Conclusion CRAd virus combined with CDDP can be potentially a novel therapeutic agent for ovarian cancer.

　　Key words： ovarian cancer;survivin; conditionally replicating adenovirus;gene therapy;combined therapy

　　条件复制腺病毒的复制能力和病毒所固有的生活周期具有显著的治疗放大作用和溶瘤作用。这种病毒在感染细胞之后，可以在肿瘤细胞内选择性复制，利用细胞毒作用杀死肿瘤细胞。接着子代病毒感染周围的肿瘤细胞，病毒继续复制并根除肿瘤细胞，而周围的正常细胞不受感染[1]。然而，这些条件复制腺病毒应用于临床仍然存在着感染效率低及肿瘤特异性不高的局限性。我们应用新构建的溶瘤病毒即新型的条件复制腺病毒CRAd-survivin-RGD4C(以下简称CRAd)来解决上述情况。它是将肿瘤特异性启动子survivin克隆在腺病毒E1基因前面，驱使E1基因在肿瘤细胞中特异性表达来提高病毒在肿瘤细胞中的复制效率，同时包括一个衣壳修饰RDG4C小肽，可以与在肿瘤细胞中特异性表达的整合素受体结合，从而提高肿瘤感染效率[2]。联合治疗是肿瘤治疗的趋势，大量文献报道基因治疗联合常规的肿瘤治疗方法可以提高治疗效果。本研究中我们探讨含survivin启动子的重组条件复制腺病毒联合顺铂(cis-diamminedichloroplatinum, CDDP)对卵巢癌细胞株HO-8910的抑制作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料 卵巢癌细胞株HO-8910 购于中国科学院上海细胞所，RPMI 1640培养基购自美国Gibco 公司，小牛血清购自Hyclone公司，青霉素、链霉素、CDDP、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、RNA酶、dNTP等均购自美国Sigma公司，CRAd-survivin-RGD4C 条件复制病毒质粒由美国阿拉巴马癌症基因研究中心的朱正卞教授惠赠。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 HO-8910 细胞贴壁生长在含有10%新生胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中，细胞培养在 5 % CO2、37℃条件下进行。

　　1.2.2 CRAd的繁殖、纯化、滴度测定、转导效率测定 参照文献[3]进行。

　　1.2.3 细胞实验 将1.0×103个/孔的 HO-8910细胞接种到96孔板中，分别进行如下实验。①CRAd实验：24 h 后分别转染不同浓度(0、 0.01、0.1、1、10和100 pfu/cell)的CRAd，2 h 后换新鲜的培养基。②CRAd+CDDP实验：不同浓度CRAd转染HO-8910细胞实验同上，24 h后加入10 mg/L 的CDDP，孵育24 h，换新鲜的培养基后继续培养。③CDDP实验：24 h 后加入10 mg/L CDDP。④阴性对照实验：不加入CRAd、CDDP，仅以磷酸盐缓冲液(PBS)替代(PBS组)。以上实验各浓度组各设3个复孔。

　　1.2.4 细胞活力检测 应用MTT法，分别于细胞培养的第2、4、6、8、10天取样进行检测。收集细胞后加入 10 g/ L MTT 20 μl，同样条件继续培养 4 h，吸出培养液，加入 200 μl 二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解 10 min , 放入全自动酶标仪，上机检测光密度(D) 值。阴性对照调零，测定波长为 490 nm。细胞存活率(%)=实验组D值/ 阴性对照组D值×100 %。

　　1.2.5 细胞凋亡检测 各组细胞培养10天后，应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。收集处理后的细胞，以1000 r/ min 离心 5 min，弃上清液， PBS洗涤2遍, 细胞重新悬浮于PBS中，调整细胞浓度为 1.0×106 个/ L，70 %乙醇固定，4℃过夜后加入 1 ml PI 染液〔50 mg/L PI，20 mg/ L RNA酶，10 ml/L屈立通X2100，1 g/L枸橼酸钠(pH 值7.12～7.14)〕，4℃避光染色 30 min，上流式细胞仪检测细胞核DNA含量。多功能软件系统分析测定结果。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0 软件进行统计分析，各组间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度CRAd对肿瘤细胞的抑制作用 经MTT检测，各时点不同浓度的CRAd对于卵巢癌HO-8910细胞有程度不同的抑制，以第8、10天较为明显;当CRAd浓度达到1 pfu/cell 以上时对卵巢癌HO-8910细胞才有明显的抑制效应，即CRAd对卵巢癌HO-8910细胞的抑制作用具有剂量依赖性。见图1。

　　图1 不同浓度CRAd处理后HO-8910细胞存活情况

　　2.2 CRAd+CDDP对肿瘤细胞的抑制作用 不同浓度CRAd+CDDP及单独CRAd、CDDP实验结果显示，各浓度CRAd+CDDP对卵巢癌HO-8910细胞的抑制率较CRAd、CDDP的单独作用均有明显提高，其中以10 pfu/cell 的CRAd联合CDDP处理效果最佳;10 pfu/cell CRAd +CDDP对肿瘤细胞的抑制效率与100 pfu/cell CRAd 接近，说明联合处理可以降低病毒的用量。10 pfu/cell CRAd+CDDP及10 pfu/cell CRAd、10 mg/L CDDP单独处理结果比较见图2。

　　图2 不同方法处理后HO-8910细胞存活率

　　2.3 肿瘤细胞的凋亡 细胞凋亡检测结果显示，CRAd(10 pfu/cell)组、CDDP组及CRAd(10 pfu/cell)+CDDP组的凋亡率与PBS组相比均有明显提高，而CRAd+CDDP组的凋亡率又明显高于CRAd组及CDDP组。见图3。

　　图3 不同方法处理后HO-8910细胞凋亡情况

　　与PBS组比较：**P<0.01;与CRAd、CDDP组比较：##P<0.01[HJ*2/3〗

　　3 讨 论

　　条件复制腺病毒即肿瘤特异性增殖型腺病毒，多用于肿瘤的基因治疗。该载体利用肿瘤与正常组织及细胞间结构或代谢途径上的差异，使病毒可以特异性靶向性地在肿瘤细胞内复制、增殖，大量表达目的基因并最终裂解肿瘤细胞。以增殖型腺病毒载体作为肿瘤生物治疗的平台，可以充分利用腺病毒体积较小、弥散能力强的特点，病毒的大量增殖可以直接杀死感染的肿瘤细胞，并扩散到邻近肿瘤细胞;腺病毒溶解肿瘤细胞能释放肿瘤抗原，提呈给树突状细胞和T细胞识别，起到“瘤苗”的作用，产生抗肿瘤免疫反应;除了自身的溶肿瘤能力，增殖型腺病毒载体在大量复制增殖的同时还可使所携带的外源基因大量表达，通过多种途径杀灭肿瘤[4 ～6]。与传统的肿瘤基因治疗以及化疗方案不同，以增殖型腺病毒载体携带抗癌基因治疗肿瘤过程中所表达的抗癌活性物质不但不会像化疗药物因药物半衰期而减少，从理论上讲，只要肿瘤细胞存在，抗癌活性物质就会表达，直至杀灭全部的肿瘤细胞。

　　新型的重组条件复制腺病毒包含了一个survivin启动子，survivin是很有前景的启动子，具有在肿瘤细胞中开启、在肝脏等正常组织中关闭的特性。因此，survivin启动子可以是许多肿瘤治疗中的转录靶目标 [7]。我们在前期研究也得出同样的结论[8-9]。在新的重组腺病毒中，同时改造了病毒衣壳，将一个 RGD4C修饰体插入了腺病毒纤维节的HI环，进而显著地提高病毒转导效率[10]。survivin可以提高病毒作用于肿瘤细胞的特异性，RGD4C可以提高病毒转导到肿瘤细胞的效率，因此这一新型的重组条件复制腺病毒是一种理想的溶瘤病毒，具有高效的感染效率、复制效率和溶瘤能力。

　　另一方面，越来越多的联合治疗应用于临床。尽管单独应用病毒也具有明显的治疗作用，即病毒的复制可以导致宿主细胞破坏，一个病毒细胞内复制可获得1000倍的病毒扩增，从而使病毒感染扩散。但是临床前动物实验及临床研究表明，单一溶瘤病毒治疗不能有效地完全根治肿瘤。病毒治疗与常规的治疗方案如放疗或化疗相联合不但可以提高治疗效率，甚至可以获得完全消除肿瘤的效果。这一理论基于病毒与化疗、放疗的作用机制不同，从而使肿瘤细胞没有时间产生治疗耐受。在溶瘤腺病毒与紫杉醇联合治疗异体移植瘤模型的老鼠体内已发现可以产生累加的治疗效果 [11 ]。因此，在不久的将来联合基因治疗和常规治疗可以有效的应用于临床[11～15] 。

　　本研究中，我们应用新型的重组条件复制腺病毒联合CDDP对卵巢癌HO-8910细胞进行体外研究。结果发现，CRAd单一作用对体外HO-8910细胞的抑制作用呈剂量依赖性，即随着病毒滴度的升高，对肿瘤细胞的抑制作用增高。联合治疗对卵巢癌细胞的抑制率明显高于单一治疗及两者之和，具有协同效果。同时发现，10 pfu/cell 的CRAd联合10 mg/L的CDDP对肿瘤细胞的抑制作用可以达到100 pfu/cell CRAd对肿瘤细胞的抑制作用，提示联合治疗可以减低病毒用量，进而减低病毒的副作用。 CRAd联合化疗可以提高治疗效率的机制还不十分清楚，有以下几种假设: 溶瘤病毒和化疗的抗瘤作用机制不同，是相互独立的，因此几乎不会产生交叉耐药性;化疗可以提高病毒的复制效率， Yu等[11] 研究表明化疗能增加肿瘤细胞中溶瘤病毒的含量，提高病毒的转导效率，同时不改变病毒复制动力学;另外，由于很多化疗制剂具有免疫抑制作用，经静脉、动脉或肿瘤内注射后可以允许高剂量的病毒颗粒到达肿瘤细胞，并能保持病毒在肿瘤内持续扩散;CRAd可以提高顺铂的抗癌效率, 恶性肿瘤细胞表达腺病毒蛋白可以增加对DNA损伤药物(如顺铂)的敏感性。另外，病毒复制还可以诱导肿瘤坏死因子的产生，利用肿瘤坏死因子杀伤肿瘤细胞。

　　本研究结果提示，新型的条件复制腺病毒联合化疗对于体外的卵巢癌细胞具有良好的治疗作用, 为化疗联合病毒的临床研究提供了一些实验室依据。

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