早孕期绒毛短期培养后染色体制备方法的改进

　　作者：付燕燕1，刘福民2 ，陈红2 作者单位：(1.徐州医学院生物与遗传教研室，江苏徐州221002;2.徐州医学院附属医院生殖遗传中心，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 在以往研究的基础上，改进早孕期绒毛短期培养后染色体制备的方法。方法 采用的培养液血清浓度为5%，绒毛细胞经过48 h培养，将酶解离细胞、低渗处理与高浓度秋水仙素处理简化为一步，使用冰醋酸分步解离。结果 染色体分散好，带型清晰。结论 该技术简单省时，易于操作，成功率较高，便于临床推广使用。

　　【关键词】 绒毛;染色体

　　Modification of chromosome preparation from short-term culture of chorionic

　　villi in the first trimester of pregnancy

　　FU Yanyan1, LIU Fuming2, CHEN Hong2

　　(1.Department of Biology and Genetics, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2. Reproductive Genetics Center, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective A modified technique of chromosome preparation from short-term culture of villi was established upon previous studies. Methods The chorionic villi were cultured for 48 hours at a medium serum concentration of 5%, to merge cell enzymolysis separation from the cytotrophoblastic layer, treatment with hypotenic solution and high concentrations of colchicines treatment into one step, i.e., step-by-step dissociation by glacial acetic acid. Results The chromosomes were evenly distributed with clear banding pattern. Conclusion The technique is simple, time-saving and easy to operate, with a high success rate, which facilitates clinical popularized application.

　　Keys words: chorionic villi; chromosome

　　Simoni等[1]于1983年首先报道了应用绒毛滋养层细胞直接制备染色体的技术，此方法成为产前诊断方法上的突破。然而，这种直接制片法普遍存在分裂相少、形态及带型不理想等缺点,因而在临床病理检查中难以开展。为此，我们开展了绒毛短期培养及制片方法的研究，取得良好效果，现报告如下。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料 2008年1月—2008年8月收集50例妊娠7～14周绒毛标本，包括10例早孕人工流产绒毛组织和40例经宫颈吸取停育胚胎的绒毛组织。每例取绒毛10～20 mg进行实验。

　　1.2 方法 ①无菌条件下,将取出的绒毛组织立即放入RPMI 1640+抗生素的培养液中漂洗,在倒置显微镜下去除蜕膜组织及血污后,投入装有5 ml培养液(RPMI 1640+胎牛血清+2 mmol/L谷氨酰胺+抗生素)的培养瓶中,37℃恒温箱培养48 h。胎牛血清有0、5%、10%、20%4个浓度。②将绒毛转入含下列成分(2.0 μg/ml秋水仙素+1∶1的0.4%枸橼酸钠-0.4%KCl+EDTA-胰蛋白酶液)的溶液中，37℃处理40 min，每隔10 min悬浮1次。③加入新配制甲醇冰醋酸(3∶1)固定液1 ml预固定2 min，轻轻混匀。④离心(1 000 r/min)10 min，弃去上清液，加入固定液5 ml，吹打混匀后置于室温下固定35 min。⑤吸去固定液，加入新配制的40%冰醋酸溶液0.2 ml混匀解离1 min，随后加入0.8 ml 60%冰醋酸混匀继续解离3 min，待绒毛周围出现浑浊。⑥加入甲醇3 ml混匀，轻轻吹打数分钟，挑出绒毛枝后离心。⑦弃去上清液，加入固定液0.5 ml滴冰片，置80℃烤箱2 h。⑧0.005%胰蛋白酶液处理6～8 min，Giemsa染色。

　　2 结 果

　　不加血清组分裂相数目最多，但染色体形态不如加5%血清者，而血清浓度大于5%时，分裂相数目却有降低趋势，血清浓度为5%的时候染色体形态最佳。50例绒毛标本中46例获得分裂相，每片20～40个分裂相不等。染色体分散好，带型清晰(图1)。10例人工流产标本染色体核型：6例46，XX;4例46，XY。40例胚胎停育标本中4例未获得分裂相，在36例获得分裂相的标本中4例46，XX;6例46，XY;其余26例均是异常核型:6例69,XXX; 8例47,XX,+21;6例47,XX,+16;3例47,XX,+17;2例47,XX,+3;1例48,XY,+15，+22。 图1 用改进的绒毛短期培养法制备的染色体核型图

　　3 讨 论

　　自然流产及胚胎停育绒毛组织由于受污染和标本不新鲜等原因的影响，难以分析染色体结果。我们认为挑选质地较好的绒毛很关键，一般选新鲜、短胖、粗壮型为佳。我们在绒毛染色体制备的直接法[2]和培养法[3-4]基础上进行了一些有益的探索。在传统的绒毛培养过程中，培养液中血清的浓度变化很大，一般为5%～20%，还有的不加血清。我们的实验发现血清浓度为5%的时候染色体形态最佳，和文献报道一致[5]。细胞周期重新开始的理想恢复时间为48 h，本实验组所有绒毛细胞均经过48 h培养。我们研究发现将秋水仙素浓度提高到2.0 μg/ml，既能缩短培养时间，又能获得长短适中、形态良好的染色体核型。在国内外资料中，传统方法一般以60%冰醋酸一步解离，但染色体容易发毛。本组实验先以40%冰醋酸少量短时作用(1 min)，再加入60%冰醋酸进一步解离，从而减少对染色体的损伤，防止染色体发毛。我们还将培养后的绒毛直接放入含2.0 μg/ml秋水仙素+1∶1的0.4%枸橼酸钠-0.4%KCl+EDTA-胰蛋白酶的混合液中，即将传统的解离、秋水仙素处理和低渗处理三个步骤合并为一个步骤，从而简化过程，节省了实验时间。经过上述改良后，可使每张片子的可分析的中期分裂相数目增加2倍，染色体分散好，带型清晰，易于观察，诊断成功率达96%，且改进后的实验方法更简单省时，易于操作，便于临床推广使用。

　　【参考文献】

　　[1] Simoni G, Brambati B, Danesino C, et al.Efficient direct chromosome analyses and enzyme determinations from chorionic villi samples in the first trimester of pregnancy [J]. Hum Genet，1983，63(4):349-357.

　　[2] 向阳,王凤云,郝娜,等. 早孕绒毛细胞直接制备染色体方法的改进[J].中国实用妇科与产科杂志,1998,14(5)：273.

　　[3] 郝娜,戚庆炜,周京,等. 早孕期绒毛细胞培养和染色体制备方法的应用研究[J]. 中国实用妇科与产科杂志,2006,22(11)：839-840.

　　[4] 沈国松,张更生，邱惠麒，等.一种简便易行的绒毛细胞染色体核型检查技术[J].中国计划生育学杂志,2004,(6)：369-370.

　　[5] 辜士扬,李蒙茹,张秀玲.制备绒毛细胞染色体的研究[J].遗传,1996,18(5)：39-42.