组织芯片技术检测Galectin-3和CD44v6在子宫内膜癌中的表达及其意义

　　作者：祁旦巳，王繁，周伶俐，谢丽微，王宗敏 作者单位：温州医学院附属第二医院，浙江 温州 325000，1.病理科;2.妇产科

　　【摘要】 目的:研究Galectin-3和CD44v6在子宫内膜癌发生、发展中的意义。方法：应用免疫组化ElivisionTM法检测Galectin-3与CD44v6在18例正常增生(NE)、22例简单-复杂型增生过长(SH-CH)、30例不典型增生(AH)子宫内膜及58例子宫内膜癌(UEC)中的表达。结果：①Galectin-3、CD44v6在NE、SH-CH、AH和UEC中的表达逐渐升高，差异有显著性(P<0.05);②Galectin-3表达强度在UEC不同病理分级之间、淋巴结转移与否及肌层浸润深浅差异均有显著性(P<0.05)，与临床分期及年龄不相关(P>0.05);③ CD44v6表达在UEC临床分期之间、淋巴结转移与否均有显著性差异(P<0.05)，与分化程度、肌层浸润及年龄均不相关(P>0.05);④Galectin-3与CD44v6表达在UEC中呈显著正相关。结论：①Galectin-3的过度表达与子宫内膜异常增生及恶变有关;②CD44v6的阳性表达可以用来预测子宫内膜癌淋巴结转移状况以及对恶性程度的判断;③Galectin-3及CD44v6的共同表达有助于尽早发现子宫内膜癌的癌前病变及鉴别子宫内膜的良恶性病变。

　　【关键词】 Galectin-3;CD44v6;子宫内膜癌;组织芯片;免疫组织化学

　　Expression and clinical significance of Galectin-3 and CD44v6 in endometrial carcinoma by the application of tissue microarray QI Dan-si*，WANG Fan，ZHOU Ling-li，XIE Li-wei，WANG Zong-min.*Department of Pathology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To study the role of Galectin-3 and CD44v6 in the pathogenesis mechanism of endometrial carcinoma. Methods: Immunohistochemical staining (EliVision) was used to detect the proteins of Galectin-3 and CD44v6 in 18 cases of normal endometrium (NE)， 22 cases of simple-complex endometrial hyperplasias (SH-CH)， 30 cases of atypical endometrial hyperplasias (AH) and 58 cases of uterine endometrioid adenocracinomas (UEC). Results:①The positive expression rate of Galectin-3 and CD44v6 in NE， SH-CH， AH and UEC increased progressively， and the difference was statistically significance (P<0.05). ②The expression intensity of Galectin-3 was related with the differentiation degree， with/without lym-phatic metastasis or muscular layer invasive parameter of UEC (P<0.05). There were no statistical significances in operation staging and age of UEC. ③The expression intensity of CD44v6 was related with the operation staging and with/without lymphatic metastasis (P<0.01). There was no statistical significance of CD44v6 expression in differentiation degree， muscular layer invasion or age parameter of UEC. ④The positive expression rate of Galectin-3 was correlated with that of CD44v6. Conlusions:①The overexpression of Galectin-3 reflects the malignant level and invasive ability of endometrial carcinoma indirectly;②The overexpression of CD44v6 may predict the status of invasion、lymph node metastasis and prognoses in endometrial carcinoma. ③The expression of galectin-3 and CD44v6 plays important roles in the process of the early detection of precancerous lesion and is important in the early diagnosis of endometrial carcinoma.

　　Key words: Galectin-3;CD44v6;endometrial carcimona;tissue microarray;immunohistochemistry

　　子宫内膜癌(uterine endometrioid cracinomas，UEC)是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，近年来发病率有所增加，75%～80%的病例发生在绝经后的妇女。子宫内膜癌一旦发生转移及复发，预后较差。本研究采用组织芯片技术分析Galectin-3与CD44v6在不同类型子宫内膜中的表达，探讨两者在子宫内膜癌发生、发展、浸润转移过程中的作用，为临床子宫内膜癌的早期诊断及预后判断提供有价值的诊断指标。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本选择与分组 收集2002年1月至2007年6月在温州医学院附属第二医院行全子宫切除术或诊断性刮宫的组织标本共128例，其中正常增生反应子宫内膜标本18例，简单型-复杂型增生过长标本22例，不典型增生标本30例，子宫内膜癌标本58例。所有患者术前均未接受化疗、放疗或激素治疗等辅助治疗。子宫内膜癌患者年龄39～70岁(中位年龄55岁)，子宫内膜癌分级：G1 33例，G2～G3 25例;分期：Ⅰ～Ⅱ期49例，≥Ⅲ期9例;肌层浸润深度：无肌层浸润或浅肌层浸润(≤1/2)43例，深肌层浸润(>1/2)15例;无淋巴结转移48例，有淋巴结转移10例。

　　1.2 主要试剂 Galectin-3兔抗人单克隆抗体、CD44v6鼠抗人单克隆抗体及免疫组化ElivisionTM法试剂盒、DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发公司。

　　1.3 实验方法 所有标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，采用组织芯片制作仪制作组织芯片备用。切片4μm，按免疫组化EliVision法说明书进行操作，DAB显色，苏木素复染，显微镜下观察结果。

　　1.4 结果判定

　　1.4.1 阳性表达为棕黄色，Galectin-3主要定位于细胞质，凡是细胞质和(或)细胞核出现棕黄色颗粒的细胞均为阳性细胞。CD44v6主要存在于细胞膜，胞膜和核膜同时着色亦为阳性。

　　1.4.2 综合考虑切片中阳性细胞着色强度(Inten-sity)和肿瘤细胞阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比(Percentages)2项指标，采用IP(Intensity×Percentages)评分方法[1]——阴性：0分;阳性：1分为低表达(+);2分为中等表达(++);4分为高表达(+++)。

　　1.5 统计学处理方法 采用SPSS10.0统计分析软件进行分析，分类资料采用秩和检验和等级相关分析。

　　2 结果

　　2.1 组织芯片评估 组织芯片排列整齐，经过比较，发现芯片点组织可以代表肿瘤组织大部分的病理特点。实际有效128例。

　　2.2 Galectin-3及CD44v6在不同类型子宫内膜的表达 Galectin-3主要定位于上皮的细胞质;CD44v6主要定位于上皮的细胞膜(见图1)。Galectin-3在NE中多数不表达，少数弱阳性表达;在SH-CH的细胞质表达;在AH和UEC中显示细胞质及细胞核的联合表达(见图2)。Galectin-3与CD44v6的阳性表达率从NE组到SH-CH组到AH组直到UEC组均呈逐渐升高，差异有显著性(x2Galectin-3=57.503，P <0.01;x2CD44v6=30.946，P <0.01);在AH组及UEC组的阳性表达率明显高于NE组及SH-CH组。

　　2.3 Galectin-3及CD44v6表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系 从表2可见，Galectin-3表达在分化差、浸润深肌层和有淋巴结转移的子宫内膜癌中高表达，与子宫内膜癌临床分期和年龄表达性差异无显著性。CD44v6在有淋巴结转移和手术分期晚期的子宫内膜癌中高表达，与子宫内膜癌分化程度、肌层浸润及年龄表达差异无显著性。

　　2.4 Galectin-3与CD44v6的相互关系 用Spearman等级相关分析两者呈显著正相关(rs=0.626，P =0.009)，说明Galectin-3含量随CD44v6含量增加而呈上升趋势。

　　3 讨论

　　组织芯片技术具有样本体积小、信息含量高、快速、低消耗、自身内对照和可比性强等特点[2]，可使不同组织标本在相同的条件下得到相同方式处理，可消除差异，提高阳性检测率。迄今，采用组织芯片技术观察子宫内膜癌及其癌前病变组织的研究国内外报道不多。本研究成功构建了包含58例子宫内膜癌及子宫内膜增生症的128个微阵列的组织芯片，并利用组织芯片进行研究。

　　Galectin-3及CD44v6都属于细胞周期调控或与黏附有关的特殊蛋白质分子，在肿瘤侵袭转移中起着十分重要的作用，是目前肿瘤研究的热点。Galectin-3属于S型凝集素。已知癌症患者血液中的Galectin-3浓度比健康人的高，但一直不清楚其作用机制。最近Yu等[3]报道，细胞表面的上皮黏蛋白1(MUC1)能阻止癌细胞附着到血管壁上，但Galectin-3会攻击MUC1，使癌细胞可以附着到血管壁上并最终穿透血管壁，蔓延到其他部位。研究显示许多恶性肿瘤的进展与Galectin-3的过度表达有关[4]。Hermann等[5]通过免疫组化染色发现子宫内膜从正常及增生过长到不典型增生及癌变时，Galectin-3的表达明显增高，并提示子宫内膜不典型增生与癌变有密切的相关性。本研究也出现同样的结果。有报道[6]认为Galectin-3胞核染色提示细胞处于增生状态，反映细胞分裂活跃。在本研究中，从子宫内膜增生到癌的过程中，逐渐出现明显的核染色，提示其细胞增殖活性显著增强，说明Galectin-3的过度表达及核表达与子宫内膜异常增生及恶变有关。CD44属黏附分子家族，分布极为广泛。CD44v6是CD44的一种拼接变异体，许多研究提示CD44v6是一种转移相关基因，可能通过与透明质酸的结合而参与癌细胞的转移[7]。它的异常表达与许多人类恶性肿瘤的发生、发展和侵袭转移以及预后密切相关。国内外在CD44v6和子宫内膜癌的关系方面的研究资料不多，而且结论不一。有Stokes的研究表明CD44v6表达与子宫内膜癌肌层浸润有关，认为CD44v6可作为子宫内膜癌术前估计是否有深肌层浸润的指标[8]。项达军等[9]发现CD44v6在正常增生期子宫内膜单纯性增生、子宫内膜不典型增生及子宫内膜腺癌中表达差异有显著性。Hosford等[10]报道，随着临床分期的增加CD44V6的表达明显增高，同时其在淋巴结阴性组的表达率显著低于阳性组。Lebcanc等[11]发现，在子宫内膜癌中CD44v6蛋白过度表达与淋巴结转移和深肌层浸润有关。本研究结果显示CD44v6阳性表达可能与内膜异常增生及恶变密切相关，可成为早期诊断子宫内膜癌前病变的生物学标记之一。CD44v6表达在子宫内膜腺癌临床分期之间、淋巴结转移与否差异均有显著性，表明CD44v6在子宫内膜腺癌转移和临床进展过程中起着重要作用。检测这两种基因蛋白表达，有助于尽早发现子宫内膜癌的癌前病变并鉴别子宫内膜的良恶性病变，判断肿瘤恶性程度、预测生物学行为及估计预后，具有重要临床意义。

　　在恶性肿瘤研究中，许多学者提出了基因协同作用假说，认为至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的基因各自发挥不同作用，并相互配合，协同促进了细胞的癌变。我们的研究发现在子宫内膜腺癌中Galectin-3表达与CD44v6表达呈显著正相关，提示这可能与二者在子宫内膜腺癌的发生、发展中的作用密切相关。它们之间的作用机制有待进一步探讨。

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