CD44v6和COX-2在子宫腺肌病中的表达及其意义

　　作者：王繁，唐云炳，祁旦巳 作者单位：温州医学院附属第二医院，浙江 温州 325027，1.妇产科;2.病理科

　　【摘要】 目的 ：检测黏附分子CD44v6及环氧合酶COX-2在子宫腺肌病在位、异位内膜与正常内膜中的表达，探讨CD44v6及COX-2在子宫腺肌病发病中的作用。方法：应用组织芯片观察CD44v6及COX-2在子宫腺肌病患者在位内膜、异位内膜各30例与正常子宫内膜20例中的免疫组化表达。结果：CD44v6在子宫腺肌病异位内膜中的表达高于同期在位内膜及正常子宫内膜的表达，差异有显著性(P <0.01)。COX-2在子宫腺肌病异位、在位内膜中的表达高于正常子宫内膜，差异有显著性(P <0.01)。CD44v6在分泌期的表达显著高于增生期(P <0.05)。COX-2在分泌期、增殖期表达的差异无显著性(P >0.05)。结论：CD44v6、COX-2在子宫腺肌病患者子宫内膜表达增强，可能与子宫腺肌病的发生发展有关。

　　【关键词】 CD44v6 COX-2 子宫腺肌病 免疫组化 组织芯片

　　Expression and significance of CD44v6，COX-2 in adenomyosis WANG Fan*，TANG Yun-bing，QI Dan-si. *Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To detect CD44v6 and COX-2 expression in endometriotic and eutopic endometrium in women with adenomyosis and normal endometrium and explore investigate the role of them in the pathogenesis of adenomyosis. Methods: Expression of CD44v6 and COX-2 in 30 cases of endometriotic and eutopic endometrium of adenomyosis and 20 cases of normal endometrium with the application of tissue microarray were detected. Results: Expression of CD44v6 in endometriotic was higher than that in eutopic and normal endometrium (P <0.01). The COX-2 expression in endometriotic or eutopic endometrium with adenomyosis was significantly higher than that in normal endometrium(P <0.01). The expression of CD44v6 in secretory phase was significantly higher than in proliferative phase in normal endometrium and adenomyosis(P <0.05). No significant changes of COX-2 expression were found throughout the menstrual cycle in adenomyosis(P >0.05). Conclusion: The overexpression of CD44v6 and COX-2 may correlate with the occurrence and progression of adenomyosis.

　　Key words: CD44v6; COX-2; adenomyosis; immunohistochemistry; tissue microarray

　　子宫腺肌病(adenomyosis，AM) 指子宫内膜侵入子宫肌层生长，虽是良性疾病，其生物学行为与恶性肿瘤有很多相似之处，如病变浸润性生长、无明显界限、易复发等。AM好发于育龄妇女，近年来其发病率逐年升高，但其确切发病机制尚不清楚[1]。子宫内膜细胞的异位种植生长过程中存在着内膜细胞之间以及内膜细胞与细胞外基质(entracellular matrix，ECM)黏附和解黏附的问题。环氧化酶是前列腺素(prostaglandins， PGs)合成过程中的重要限速酶，后者与AM的病理过程如不孕和痛经有关。本研究利用组织芯片和免疫组化相结合的技术检测细胞粘附分子CD44v6及环氧合酶COX-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)在子宫腺肌症在位、异位内膜及正常子宫内膜的表达差异，初步探讨其在子宫腺肌症发病中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 30例子宫腺肌症在位及异位内膜为实验组，取自2005年3月至2008年8月间在温州医学院附属第二医院妇科行子宫切除术患者，术后病理证实为子宫腺肌病，平均年龄42.3岁(37～48岁)，其中增生期16例，分泌期14例。正常子宫内膜20例为对照组，来自同期因月经失调行诊断性刮宫术患者，病理证实为正常子宫内膜，年龄平均43.6岁(34～54岁)，其中增生期12例，分泌期8例。两组均排除其他妇科疾病，术前无激素用药史，且年龄及子宫内膜分期差异无显著性。

　　1.2 组织芯片的制作过程 所有标本均经l0%甲醛溶液固定，48 h内取材，石蜡包埋，5μm组织切片，常规HE染色病理检查后选取合适切片，用于目标组织的定位。组织芯片制作:采用组织芯片制作仪(Microarrayer，BeecherInstruments，USA)制作组织芯片。制作5个微阵蜡块(6×6阵列)进行研究。采用Envision方法对各组子宫内膜的组织芯片进行免疫组化染色。每例蜡块分别切片进行二种标记染色及阴性对照。CD44v6、COX-2 鼠抗人单克隆抗体、 SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。免疫组化染色步骤严格按试剂说明书进行，以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 染色结果判定 CD44v6和COX-2阳性细胞呈棕黄色，阳性反应分布在细胞膜和细胞质。免疫组化结果结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分：a为阳性细胞百分比(阳性细胞占1%～20%=1，21%～50%=2，51%～75%=3，76%～100%=4)，b为阳性细胞染色强弱(阴性=0，弱阳性=1，中度阳性=2，强阳性=3)，a，b两项乘积分数为最后得分。

　　1.4 统计学处理方法 三组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。同一部位，不同月经周期的表达比较采用t检验。

　　2 结果

　　CD44v6阳性细胞的胞膜被染成棕黄色，胞浆内虽有CD44v6表达，但着色比胞膜浅。COX-2表达阳性信号(棕黄褐色颗粒)主要位于腺体细胞的胞质内及核周， 除小部分间质外，大部分间质及其他细胞均为阴性。CD44v6在子宫腺肌病异位内膜中的表达显著高于同期在位内膜与正常子宫内膜的表达(P <0.01)。COX-2在子宫腺肌病异位、在位内膜中的表达显著高于正常子宫内膜(P <0.01)，子宫腺肌病在位内膜与异位内膜的COX-2表达比较， 差异无显著性(P >0.05)。在正常内膜异位及在位子宫内膜腺上皮及间质细胞中，增生期仅见CD44v6的弱阳性表达，分泌期表达水平增加，差异均有显著性(P <0.05)。COX-2在分泌期和增殖期表达的差异无显著性(P >0.05)，即内膜中COX-2表达不随月经周期而变化(见表1)。

　　3 讨论

　　组织芯片与免疫组化相结合用于检测组织中不同基因的蛋白表达情况，使每一组织标本都得以相同方式处理，提高了阳性检测率。本研究成功构建了包含153个微阵列的组织芯片，并利用其进行CD44v6和COX-2表达的研究。几乎所有标本均能保持它们的组织学类型特征，且染色背景清晰、对比良好。

　　有学者认为AM是一种来源于子宫内膜的病变，可能是子宫内膜基底层受到刺激因子影响而向肌层异位生长而形成的[2]。CD44v6属未分类的黏附分子，它是透明质酸的受体，介导细胞与基质的黏连。它在调控细胞的生长、生存、分化和迁移中发挥重要作用。其表达上调可改变肿瘤细胞表面黏附分子的功能，有助于肿瘤细胞获得转移潜能，增加肿瘤转移的机会。本研究利用组织芯片和免疫组化技术结合检测CD44v6在AM在位内膜、异位内膜，正常子宫内膜中的表达，发现CD44v6在AM在位内膜腺体及正常子宫内膜腺体中少量表达，异位内膜CD44v6表达明显增高，提示异位的子宫内膜腺上皮使细胞内膜与基质的黏附性增强，在异位处侵蚀细胞外基质，并在异位种植、生长。CD44v6还能参与细胞伪足的形成[3]，影响细胞的迁移过程，CD44v6异常表达增加了异位内膜的游走性，使AM 异位内膜在子宫肌层弥漫性播散。此外，CD44v6还可以通过上调MMP-2的表达提高细胞的移动浸润能力[4]，从而促进细胞的生长和转移。在正常子宫内膜腺上皮，各期均见CD44v6分子的表达，分泌期较增生期增加，其表达的增加介导细胞间的黏附，影响子宫内膜的容受性，有利于胚泡的黏附与植入。免疫组化显示CD44v6阳性细胞胞膜被染成棕黄色，胞浆内虽也有表达，但着色较细胞膜浅，反映出CD44v6主要定位于细胞膜，胞浆内较少。CD44v6蛋白的细胞外区决定着与细胞外基质黏附作用，故细胞膜上CD44v6的表达对其与间皮细胞的黏附结合是至关重要的。CD44v6的高表达，促进了异位内膜细胞异位种植生长的黏附环节。

　　COX-2在大多数正常组织中不表达，在细胞受到各种刺激，如炎性递质、生长因子、细胞因子、促癌剂等的诱导下迅速合成COX-2 mRNA，参与炎症过程和肿瘤的细胞增殖与分化过程[5]。Matsuzaki等[6]研究显示，COX-2在子宫内膜异位症的在位、异位内膜中均有明显表达且高于于正常内膜。国内有研究显示，不论AM在位内膜及异位内膜均有COX-2 mRNA及其蛋白表达，均显著高于正常平均水平[7]。本实验发现COX-2在异位和在位内膜中的高表达，两者表达水平无差异，而与正常子宫内膜相比差异有显著性，说明COX-2可能参与了AM的发生、发展过程。AM患者在位、异位子宫内膜自身免疫反应增强，如巨噬细胞活性增强、子宫内膜腺上皮免疫球蛋白及补体沉积、黏附分子的异常等，结果使免疫细胞和巨噬细胞分泌各种细胞因子，包括 IL-1和IL-2，这些细胞因子诱导COX-2表达[8]。高表达的COX-2，刺激PGs不断产生前列环素2(PGE2)。另外，COX-2通过甾体激素——芳香化酶途径发挥作用，子宫腺肌病为雌激素依赖性疾病，雌激素可激活COX-2从而促进PGE2合成，PGE2又可通过上调芳香化酶活性而促进雌激素的合成，两者间存在正反馈环路[9]。本研究发现增生期和分泌期COX-2表达的差异无显著性，提示异位内膜COX-2作用贯穿于整个月经周期，而这可能是AM病程迁延不愈及进展的原因之一。

　　在对子宫腺肌病的研究中，异位病灶本身所具有的特点和免疫反应异常在发病过程所起的作用已引起了广泛的关注。黏附分子CD44v6及环氧合酶COX-2作为控制细胞生长、迁徙，促进细胞增殖、促进血管形成的重要调控因子，在子宫腺肌病中过表达，可能参与了该病的发生过程，这一发现为临床预防及诊治提供了线索。

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