Livin，Survivin及HPV16/18在宫颈癌及癌前病变中的表达和相关性研究

　　作者：施铮铮，朱华，郑飞云，胡燕，张虎祥，万丽 作者单位：温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000，1.妇产科;2.病理科

　　【摘要】目的 ：研究宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌中凋亡抑制因子Livin，Survivin的表达及HPV16/18感染情况，探讨它们在宫颈癌及癌前病变中的意义及相关性。方法:采用免疫组织化学SP法对81例宫颈癌、74例CIN、20例正常宫颈组织进行Livin的检测，应用原位杂交法进行Survivin及HPV16/18的检测。结果：Livin，Survivin在正常宫颈组织中几乎不表达，在CIN和宫颈癌中表达上调，并随CIN级别和肿瘤临床分期的升高、肿瘤分化程度的降低、伴有淋巴结转移而上升(P<0.05);而与宫颈癌的病理类型、肿块生长类型无相关性(P>0.05)。HPV16/18在正常宫颈组织、CIN 和宫颈癌中感染率逐渐升高(P<0.05)，但与CIN级别、宫颈癌的临床分期、组织分化、病理类型、肿块类型、淋巴结转移无关(P>0.05)。Survivin的表达与HPV16/18感染呈正相关;Livin的表达与Survivin呈正相关，但与HPV16/18感染不存在相关性。结论：Livin与Survivin的表达相似，在宫颈癌的发生、发展中可能有协同促进抗凋亡作用，并提示与肿瘤的恶性程度及不良预后有关;Survivin与HPV16/18对宫颈癌发生可能起协同作用。

　　【关键词】 凋亡抑制因子 Livin Survivin HPV16/18 CIN 宫颈癌

　　Expression and correlative research of Livin，Survivin and HPV16/18 in cervical carcinoma and precancerous lesion SHI Zheng-zheng*，ZHU Hua，ZHENG Fei-yun，HU Yan，ZHANG Hu-xiang，WAN Li. *Department of Gynaecology and Obstetrics，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To investigate the expression of Livin and Survivin which are apoptosis-profilin in CIN and cervical carcinoma， and detect the infection of HPV16/18， explore their clinical significance and correlatiuity in cervical carcinoma and its precancerous lesion. Methods: The expressions of Livin in 81 cases of cervical carcinoma， 74 cases of CIN and 20 cases of normal cervix were examined with SP immunohistochemistry. The expressions of Survivin mRNA and HPV16/18 DNA were examined with in situ hybridization. Results: Livin and Survivin were seldom expressed in normal cervical tissue，and were overexpressed significantly in CIN and cervical carcinoma tissue. The increased expression of Livin and and Survivin were related to the higher grades of CIN，and also related to the higher clinical stages， the lower histodifferentiation， and lymphnode metastasis in cervical carcinoma(P <0.05). They were not associated with pathological type and tumor growth type(P >0.05). The infection ratio of HPV16/18 was significantly higher in CIN and cervical carcinoma than that in normal cervical tissue， and there was a significant difference between the three (P <0.05). But it was not associated with the grade of CIN， clinical stage， histodifferentiation， pathological type， tumor growth type and lymphnode metastasis(P >0.05). There was a correlation between Survivin and HPV16/18 in cervical carcinoma. So was between Livin and Survivin. But there was no correlation between Livin and HPV16/18. Conclusion: The expression of Livin is similar to Survivin. The coexpression of them suggests to play mutual promoting roles in the occurrence and development of cervical carcinoma and imply malignant degree of tumor and patients’poor prognosis. Survivin may participate in the occurrence of cervical carcinoma in coordination with HPV16/18.

　　Key words: apoptosis-profilin;Livin;Survivin;HPV16/18;CIN;cervical carcinoma

　　宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤。流行病学调查显示，人乳头状瘤病毒(HPV)感染、细胞癌基因的激活、抑癌基因的失活和细胞凋亡的抑制，均参与了宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈癌的发生、发展。近年研究发现，凋亡抑制蛋白(Inhibitors of apoptosis proteins，IAPs)家族在细胞凋亡的基因调控中发挥重要作用[1]。目前，IAPs家族已发现有8个成员，即NAIP，XIAP，cIAP-1，cIAP-2，生存素(Survivin)，apollon，ILP-2和活素(Livin)，其中Survivin与Livin作为家族的新成员，由于发现晚、作用强而日益成为人们关注的癌症治疗的靶点。我们采用免疫组织化学检测宫颈癌及其癌前病变组织中Livin的表达情况，采用原位杂交法检测Survivin的表达及HPV16/18的感染情况，探讨它们在CIN及宫颈癌发生、发展中的意义及相关性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 选取2006年1月至2008年3月间因CIN或宫颈癌在我院诊治患者的宫颈标本155例，包括81例宫颈癌[患者年龄22～78岁，平均(49.16±12.35)岁]和74例CIN[患者年龄19～71岁，平均(46.16±8.75)岁]，均经病理学诊断证实。获取标本前患者均未接受放、化疗及其他辅助治疗，无合并其他内外科疾病。CIN分级：I级13例，II级26例，III级35例。宫颈癌患者根据2000年再次修订后的国际妇产科联盟(FLGO)提出的分期标准[2]进行临床分期：Ia期9例，I b期17例，II a期33例，II b期12例，III期10例;按照癌组织分化程度分为：高分化14例，中分化29 例，低分化38例;按照肿瘤生长类型分为：外生型39例，内生型15例，溃疡型16例，颈管型11例;按照病理类型分为宫颈鳞状细胞癌70例，宫颈腺癌11例。81例宫颈癌患者中有54例行广泛性子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术(包括I a期3例、I b期17例、II a期33例、II b期1例)，术后病理报告有淋巴结转移者21例，未发现淋巴结转移者33例;余27例患者中I a期6例行全子宫切除术，II b期11例和III期10例均行放射治疗。另取20例正常宫颈组织(包括宫颈良性病变)作对照，患者年龄28～65岁，平均(44.15±6.16)岁。三组年龄相比差异无显著性(P>0.05)。

　　1.2 试剂与方法 采用SP免疫组织化学方法检测Livin蛋白。一抗为兔抗人Livin多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，工作浓度为1:50。将已知的乳腺癌切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液代替一抗，作为阴性对照。采用原位杂交法检测Survivin mRNA的表达及HPV16/18 DNA的感染情况，前者试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，后者试剂盒购自福建泰普生物科学有限公司。以不加Survivin寡核苷酸探针或HPV16/18寡核苷酸探针只加预杂交液作为阴性对照。实验步骤均按试剂盒说明书进行。

　　1.3 结果判定 采用Olympus光学显微镜，用半定量积分法判断结果：光镜下，Livin蛋白和Survivin mRNA 阳性表现为细胞浆中出现淡黄色至棕黄色颗粒。随机观察10个高倍镜视野，按每高倍镜视野阳性细胞数百分比记分：阳性细胞数小于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，大于75%为4分。按着色强度记分：未染色记为0分，染色呈淡黄色记为1分，染色呈黄色记为2分，染色呈棕黄色记为3分。两种记分的乘积即为阳性强度：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。+～+++视为阳性表达。HPV16/18 DNA阳性细胞表现为细胞核中出现浅黄至棕色不等的颗粒。

　　1.4 统计学处理方法 三组研究对象年龄的比较采用单因素方差分析;相关因素中各阳性表达率的比较采用x2检验;两者相关性研究采用Spearman等级相关分析。

　　2 结果

　　2.1 CIN和宫颈癌组织中Livin，Survivin的表达 Livin蛋白、Survivin mRNA表达阳性细胞呈局灶性或弥漫性分布，胞核呈浅蓝色，背景清晰。两者在正常宫颈组织中不表达，而在宫颈癌和CIN中的阳性表达率均显著高于正常宫颈组织(P<0.01)，且在宫颈癌中的阳性表达率高于CIN(P<0.05)，CIN III级中两者的阳性表达率高于CIN I～II级(P<0.05)。见表1、图1～4。

　　2.2 Livin，Survivin表达与宫颈癌临床病理参数的关系 Livin蛋白、Survivin mRNA阳性表达与肿瘤临床分期、分化程度、淋巴结有无转移有关。随着肿瘤临床分期的升高和分化程度的降低，两者表达阳性率逐渐上升。而Livin蛋白、Survivin mRNA的表达与宫颈癌的病理类型、肿块生长类型无相关性。见表1。

　　2.3 HPV16/18在CIN和宫颈癌中的感染情况及与宫颈癌临床病理参数的关系 HPV16/18在正常宫颈组织中的阳性表达率为5%(1/20)，明显低于在CIN和宫颈癌中的表达(均P<0.01)，而在宫颈癌中的表达明显高于CIN。不同CIN分级及宫颈癌的临床分期、组织分化、病理类型、肿块类型、淋巴结有无转移之间HPV16/18表达无差异。见表1、图5～6。

　　2.4 三者在宫颈癌中的相关性分析 在宫颈癌组织中Livin蛋白与Survivin mRNA的表达呈正相关(rs=0.269，P<0.05);Survivin mRNA的表达与HPV16/18感染呈正相关(rs=0.279，P<0.05);Livin蛋白的表达与HPV16/18感染无相关性(rs=0.160，P>0.05)。

　　3 讨论

　　Livin基因是2000年最新发现的人类IAPs家族的一个新成员。Lin等[3]从人类胚肾cDNA文库中克隆得到，将其称为肾脏凋亡抑制蛋白;Kasof等[4]根据同源检索发现该基因并将之命名为Livin;Vucic等[5]发现该基因在人黑色素瘤细胞中高表达，又称之为黑色素瘤凋亡抑制蛋白。Survivin是IAPs家族中结构最简单的蛋白分子，但它是迄今发现作用最强的凋亡抑制因子，是由Ambrosini等[6]等于1997年发现并克隆的，其结构和功能研究已较为透彻。

　　Han-seong等[7]研究表明，在宫颈癌及其癌前病变中，Survivin mRNA表达上调，其表达阳性率与宫颈癌的组织分级程度和临床分期呈正相关，提示Survivin基因表达发生在宫颈癌恶性转化的早期，并且其可成为判断宫颈癌预后的有价值指标。Livin与宫颈癌的研究始于2001年，Kasof等[4]用含有Livin基因的质粒转染人宫颈腺癌细胞系HeLa细胞并予以相应的抗体检测其表达产物，发现细胞核及胞质内同时呈纤维丝样染色。而对CIN和宫颈癌的临床研究，国内外鲜有报道。

　　本实验结果显示，Livin与Survivin相似，在正常宫颈组织中两者不表达，在CIN和宫颈癌组织中两者的阳性表达率逐渐升高，表明与宫颈癌的发生、发展有一定作用;两者在CIN III级的阳性表达率高于CIN I～II级，提示可能是宫颈癌前病变进一步恶化的早期信号。宫颈癌临床分期越晚、组织分化程度越低、存在淋巴结转移，两者的阳性表达率则越高。在宫颈癌IIb～III期中的表达率高于I～IIa期，低分化癌中的表达率高于中高分化癌，盆腔淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，表明Livin和Survivin的高表达能早期预测并反映宫颈癌的恶性侵袭和转移能力，预示此类患者的不良预后，对临床治疗有指导意义。Livin和Survivin在多数肿瘤组织中均呈高表达，两者可能存在相似性。两者在肿瘤中共同表达的相关性仅见于胃癌、乳腺癌、脑胶质瘤组织的相关研究[8-10]，未见两者在宫颈癌中的相关性研究。本研究表明Livin和Survivin在宫颈癌中表达呈正相关，提示两者均参与了CIN及宫颈癌发生、发展中的不同阶段，具有协同促进抗凋亡作用。

　　大量流行病学和生物学资料显示，高危型HPV感染是诱发宫颈癌的重要原因。90%以上的宫颈癌组织携带高危型HPV DNA，主要为HPV16、HPV18等亚型，可导致CIN II、III级病变和宫颈癌的发生。本研究结果显示，HPV16/18在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌中感染率逐渐升高，但与CIN级别、宫颈癌临床分期、组织分化、病理类型、肿块类型、淋巴转移无关，提示HPV16/18是宫颈癌致病的首要启动因子，并需与其他细胞因子、致癌基因共同作用。刘凤英等[11]研究结果显示，在宫颈癌组织中，HPV16E6 mRNA的表达水平与Survivin蛋白的阳性表达呈显著正相关，由此推测HPV可能直接或间接调节Survivin蛋白的表达和细胞分布，两者对宫颈癌发生可能起着协同作用。本研究结果亦提示宫颈癌中Survivin mRNA的表达与HPV16/18感染呈正相关，由此推测前者可能通过调节细胞凋亡过程参与HPV介导的宫颈癌变过程。而Livin蛋白的表达与HPV16/18感染无相关性，其机制还有待进一步验证。

　　【参考文献】

　　[1] Nachmias B,Ashhab Y,Ben-Yehuda D.The inhibitor ofapoptosis protein family (IAPs):an emerging therapeutictarget in cancer[J].Semin Cancer Biol,2004,14(4):231-243.

　　[2] 乐杰.妇产科学[M].7版.北京:人民卫生出版社,2008:265.

　　[3] Lin JH,Deng G,Huang Q,et al.KIAP,a novel member of theinhibitor of apoptosis protein family[J].Biochem BiophysRes Commun,2000,279(3):820-831.

　　[4] Kasof GM,Gomes BC.Livin,a novel inhibitor of apoptosisprotein family member[J].J Biol Chem,2001,276(5):3238-3246.

　　[5] Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et al.ML-IAP,a novelinhibitor of apoptosisthat is preferentially expressed in hu-man melanomas [J].Curr Biol,2000,10(21):1359-1366.

　　[6] Ambrosini G,Adida DC,Altieri DC.A novel anti-apoptosisgene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8):917-921.

　　[7] Han-seong K,Katsuya S,Suang-hye P.Expression of survivinin CIN and invasive squamoua cell carcinoma of uterinecervix[J].Anticancer Res, 2002,22(2A):805-808.

　　[8] 鲁祥石,刘彦龙,王涤,等.凋亡抑制蛋白 Livin和 Survivin在乳腺癌中的表达及意义[J].中国癌症杂志,2007,17(7):542-545.

　　[9] 王同杉,游思洪,葛红梅,等.凋亡抑制蛋白livin 在人胃癌中的表达以及和survivin 表达的关系[J].南京医科大学学报,2006,26(1):39-43.

　　[10] 刘效锋.Survivin、Livin在脑胶质瘤组织中的表达及意义[J].数理医药学杂志,2008, 21(3):280-282.

　　[11] 刘凤英,徐晓明,刘毅智,等.子宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16E6mRNA表达与survivin蛋白表达的相关性[J].中华妇产科杂志,2005,40(9):627-630.