细胞间黏附分子-1在子宫内膜异位症患者在位内膜组织中表达的研究

　　作者：徐兰枝，李亚里，李 洁

　　【摘要】 目的 探讨在位子宫内膜细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达变化与子宫内膜异位症发病的关系。方法 收集子宫内膜异位症患者在位子宫内膜34例，其中增殖期16例，分泌期18例;对照组在位子宫内膜32例，其中增殖期12例，分泌期20例。用免疫印迹法对这些组织进行ICAM-1蛋白的鉴定，并用VDS扫描法对蛋白电泳图进行半定量检测。实验结果用方差分析和t检验进行统计学处理。结果 (1)ICAM-1的分子量在97～116kD之间;(2)ICAM-1在月经周期各阶段的表达无明显差异，P=0.08;(3)子宫内膜异位症患者在位子宫内膜的ICAM-1表达量明显低于对照组，P=0.013。结论 子宫内膜异位症患者在位子宫内膜ICAM-1的表达及变化可能与内异症的发生机制有关，进一步论证了“在位内膜决定论”新学说。

　　【关键词】 子宫内膜异位症;细胞间黏附分子-1;免疫印迹

　　Analysis of intercellular adhesion molecule1 in endometrium of endometriosis

　　XU Lanzhi,LI Yali,LI Jie.Department of Obstetrics and Gynecology,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China

　　【Abstract】 Objective To study the relationship between intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) on endometrium and endometriosis.Methods The expression of ICAM1 protein were determined by immunoblotting method in endometrium of 34 endometriosis (16 in follicular phase and 18 in luteal phase) and 32 nonendometriosis subjects (12 in follicular phase and 20 in luteal phase).The results were scanned and semiquantified,and then analysed by F test and T test.Results (1)The molecular weight range of ICAM1 was 97～116kD.(2)ICAM1 expression on endometrium in menstrual cycle showed the same trend(P=0.08).(3)Endometrium from patients with endometriosis expressed significantly fewer ICAM1 protein than those without endometriosis(P=0.013).Conclusion In patients with endometriosis,the significant changes of ICAM1 on endometrium may be related to the development of endometriosis,it may indicate endometrium decision theory.

　　【Key words】 endometriosis;intercellular adhesion molecule1;immunoblot

　　子宫内膜异位症(简称内异症)的发病机制至今尚未阐明，目前认为细胞因子、趋化因子、血管生成因子的异常与内异症的发生密切相关[1]。其中，在黏附过程中起重要作用的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)广受关注。本研究旨在测定ICAM-1在内异症患者和对照组在位子宫内膜表达的差异，探讨其在内异症发生过程中所起的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 资料来源

　　1.1.1 研究组 2004年8月～2005年4月就诊于我院妇产科，因内异症行卵巢子宫内膜异位囊肿剥除术和异位病灶切除术的患者34例(所有患者均经病理证实为内异症患者)，其中增殖期16例，分泌期18例，年龄25～45岁，无其他内、外科疾病，术前3个月未曾使用激素治疗。术前刮取子宫内膜，标本置液氮保存。

　　1.1.2 对照组 为2004年8月～2005年4月因子宫肌瘤、卵巢成熟性畸胎瘤、卵巢良性囊腺瘤、不孕症等良性妇科疾病行全子宫切除术或卵巢囊肿剥除术的患者32例，其中增殖期12例，分泌期20例，年龄25～45岁，患者亦无其他内、外科疾病，术前刮取子宫内膜，标本置液氮保存。

　　1.2 主要试剂及方法

　　1.2.1 标本处理 取组织约0.05～0.25g，每100mg组织加入1ml RIPA裂解液和10μl PMSF(RIPA中含有SDS，NP-40去氧胆酸钠，偏钒酸钠，EDTA，PBS等)，将匀浆器埋在冰里，间或匀浆至组织完全裂解。然后转移到1.5ml离心管中，4℃，18000r/min，离心30min。弃沉淀物，将上清液转移到新的无菌离心管中，-20℃保存待测。上清液中含有待测可溶性ICAM-1。

　　1.2.2 蛋白定量 取上清液20μl用双蒸水稀释至1ml，用英国Pharmacia Biotech公司出品的核酸蛋白测量仪测量260nm和280nm处的吸光度，得出蛋白浓度，再换算成原液中的蛋白浓度。

　　1.2.3 免疫印迹法 (1)蛋白电泳：①灌制分离胶，约30min凝胶聚合。②灌制堆积胶，约30min凝胶聚合。拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，然后将变性后的蛋白质标准品(SIGMA公司产品)和样品加入样品孔中，恒压200V，电泳35～40min。其中一块胶直接染色(考马斯亮蓝R-250染色，室温，10min)，另一块胶进行免疫印迹检测。(2)转移：①将硝酸纤维素膜浸泡在转移缓冲液中15～20min，将凝胶在转移缓冲液中浸泡15～30min。②聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”的制作。③恒流200mA，转移150min。蛋白质标准品用丽春红S进行总蛋白质染色。(3)免疫检测：参照上海申能博彩生物科技有限公司免疫印迹显色试剂盒步骤。①用镊子取出膜，放入合适的杂交袋中，中封闭液封袋，4℃过夜。②倒出封闭液，加入用封闭液稀释的单克隆抗体(ICAM-1抗体是美国Santa Cruz Biotechnology公司产品)，封袋，室温振荡60min。③倒出一抗，将膜放到玻璃培养皿中，用TBS洗膜10min×4次。④将膜转移到新的杂交袋中，加入用封闭液稀释(1∶500)的二抗，室温振荡60min。⑤TBS洗膜10min×4次。⑥碱性磷酸酶显色，37℃，25～30min，用双蒸水洗膜终止反应。膜晾干后拍照。

　　1.2.4 扫描定量 将考马斯亮蓝染色后的凝胶放在Amersham Pharmacia Biotech图像扫描仪上扫描，得到每点的面积扫描定量值，并换算成单位蛋白浓度值(mg/ml)。

　　1.3 统计学方法 结果以(x±s)表示，采用STATA 7.0软件进行方差分析和t检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 蛋白定量结果 对照组在位子宫内膜蛋白浓度平均为(38.06±1.88)mg/ml，研究组在位子宫内膜蛋白浓度平均为(38.17±2.24)mg/ml，两组间差异无显著性(P=0.9)。

　　2.2 免疫印迹检测结果 蛋白质标准品共显出6条粉红色带，依次为205kD、116kD、97kD、84kD、66kD、55kD。对转移后的膜进行碱性磷酸酶显色后，在相当于蛋白质标准品上第2～3条带之间位置出现一条暗粉色带。说明ICAM-1的分子量在97～116kD之间，由此我们已成功地将ICAM-1蛋白从在位子宫内膜中提出。

　　2.3 蛋白电泳图VDS扫描分析结果

　　2.3.1 两组患者ICAM-1表达量比较 内异症患者在位子宫内膜ICAM-1的表达量为(1.16±0.057)mg/ml，对照组ICAM-1的表达量为(1.34±0.13)mg/ml，两者相比差异有显著性(P=0.013)。

　　2.3.2 不同月经周期ICAM-1表达量比较 内异症患者增生期在位子宫内膜ICAM-1的表达量为(1.11±0.007)mg/ml，分泌期为(1.17±0.07)mg/ml，两者相比差异无显著性(P=0.28);对照组增生期在位子宫内膜ICAM-1的表达量为(1.34±0.009)mg/ml，分泌期为(1.24±0.14)mg/ml，两者之间差异亦无显著性(P=0.08)。蛋白电泳图如图1所示。以左起第一泳道为例，每条带对应的峰值如图2所示。 图1 蛋白电泳图

　　3 讨论

　　3.1 ICAM-1的生物学特性 ICAM-1属免疫球蛋白超家族，是一种含505个氨基酸的单链跨膜糖蛋白，本研究测定其分子量在97～116kD之间。具有与淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)结合，并介导细胞毒性细胞免疫的作用。广泛分布于造血和非造血细胞。正常情况下，细胞只表达极低水平ICAM-1，但在炎症、肿瘤等过程中，ICAM-1表达明显上升。ICAM-1是一个重要的免疫活化及疾病进展的标志物[2，3]。其主要生理作用是介导细胞-细胞间及细胞与细胞外基质间的黏附作用。

　　3.2 ICAM-1与“在位子宫内膜决定论” 内异症是一种始于细胞水平而终止于以盆腔疼痛和不孕为特点的持续性病变[4]。发病率呈逐年上升趋势，在普通人群中的发病率约为6%～8%，而在不孕、痛经等妇女中可高达30%～45%。关于其确切发病机制，一直令临床医师困惑。目前，Sampson的经血逆流种植学说被人们广泛接受，但它不能解释为什么多数人都有经血逆流，而只有10%～15%妇女罹患内异症。对此，国内外学者进行了大量研究工作，并提出“在位内膜决定论”的新理论，认为子宫内膜碎片可完成黏附、侵袭和血管形成全过程，主要取决于不同在位内膜的生物学特性，证实其是以基因特异性差异为基础的[5]。

　　Thomson等[6]对人类子宫内膜ICAM-1的表达进行了研究，发现ICAM-1在整个月经周期中位于内膜上皮表面、血管内皮及内膜间质细胞中。人类子宫内膜上ICAM-1的广泛分布说明该分子参与血管、腺体的功能及调节白细胞进入组织。Vigano等[7]研究了ICAM-1基因的密码子241(G/R241)和469(E/K469)上两个多型性的位点，发现R241等位基因发生率仅比对照组略高，而在Ⅳ期内异症患者却明显高于对照组，认为ICAM-1基因区的多型性可能提高了生育期妇女对内异症的敏感性，具有临床价值。然而Yamashita等[8]研究了日本妇女ICAM-1基因上G241R和K469E的多态性与内异症发生的关系，结果发现研究组与对照组无明显差异，认为G241R和K469E的多态性与日本妇女发生内异症无明显相关性。因此，ICAM-1基因差异在内异症发生中所起的作用是否存在种族及地域差异有待进一步探讨。1999年伍俊萍等[9]用免疫印迹法定量ICAM蛋白，结果研究组在位子宫内膜的表达量显著低于同期对照组。之后另一些研究者用免疫组化法测定ICAM-1在内异症和非内异症患者子宫内膜上的表达，得出与之相一致的结果[10，11]。说明内异症患者的在位子宫内膜已经发生了变化，可以导致细胞解聚，使子宫内膜上皮细胞之间以及子宫内膜上皮细胞与基质之间的黏附作用降低，从而变得易于解离、脱落[9]。

　　本研究采用免疫印迹法测定ICAM-1蛋白于在位子宫内膜上的表达，结果表明研究组明显低于对照组，且在整个月经周期不同阶段的表达一致，这与Tabibzadeh等[12]研究结果相同。进而分析雌激素对ICAM-1的影响是疾病发生的原因之一，而ICAM-1在内异症发生中亦起重要作用。由此，对于内异症患者ICAM-1发生变化的原因及机制应深入研究。

　　3.3 ICAM-1诊治设想及进展 目前，内异症的治疗方法主要采用手术和药物治疗，但高复发率一直为临床难点。内异症的基础研究将进一步推动临床治疗的进展，抗黏附、抗侵袭、抗血管生成药物会逐步应用于临床。近年来国内首次成功构建的猕猴内异症模型[13]，不但为研究内异症的发病机制和药物治疗提供了实验动物模型，更有力地证明了该病的遗传相关性且不同的在位内膜间存在差异，此理论在内异症形成中起到决定性作用。因此，对在位内膜进行调控、干预和治疗，即“源头治疗”既可达到治疗内异症病灶目的，又有利于防止出现新的内异症病灶，可望收到“标本兼治”的理想效果[14]。对于“源头治疗”的理论进行论证降低复发率已成为目前亟待解决的问题。本研究证实内异症患者与对照组在位子宫内膜间ICAM-1蛋白的表达所存在的差异，有望为内异症的不同药物及不同途径治疗提供新的思路，以提高内异症患者的生活质量、提高受孕率及减少复发。

　　(本文彩图见封三)

　　【参考文献】

　　1 Lebovic DL,Muelller MD,Taylor RN,et al.Immunobiology of endometriosis.Fertil Steril,2001,75(1):1-10.

　　2 孙宇辉，胡桂英，王洪艳.子宫内膜异位症中细胞间黏附分子的表达.哈尔滨医科大学学报，2001，35(3)：232-234.

　　3 Tailor A,Granger DN.Role of adhesion molecules in vascular regulation and damage.Curr Hypertens Rep,2000,2(1):73-78.

　　4 曹泽毅.中华妇产科学,第2版.北京：人民卫生出版社，2004，1477-1529.

　　5 郎景和.子宫内膜异位症研究的新里程.中华妇产科杂志，2005，40(1)：3-4.

　　6 Thomson AJ,Greer MR,Young A,et al.Expression of intercellular adhesion molecule-1 and ICAM-2 in human endometrium: regulation by interferon-gamma. Mol Hum Reprod,1999,5(1):64-70.

　　7 Vigano P,Infantino M,Lattuada D,et al.Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) gene polymorphisms in endometriosis.Molecular Human Reproduction,2003,9(1):47-52.

　　8 Yamashita M,Yoshilda S,Kennedy S,et al.Association study of endometriosis and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) gene polymorphisms in a Japanese population.J Soc Gynecol Investig,2005,12(4):267-271.

　　9 伍俊萍，张俊慧，刘银坤,等.整和素B3和细胞内黏附分子在子宫内膜异位症在位与异位内膜组织中的表达.中华妇产科杂志，1999，34(4)：204-206.

　　10 谢恺俐，刘静兰，汤巧玲,等.ICAM-1、VEGF在子宫内膜异位症中的表达.中国新医药，2003，2(3)：11-13.

　　11 章汉旺，阎桂英，朱桂金,等.细胞间黏附分子-1在子宫内膜异位症患者在位、异位内膜中的表达.华中科技大学学报(医学版)，2004，33(2)：186-188.

　　12 Tabibzadeh S,Kong QF,Babaknia A,et al.Expression of adhesion molecules in human endometrial vasculature throughout the menstrual cycle.J Clin Endocrinol Metab,1994,79:1024-1032.

　　13 邹杰，李亚里.子宫内膜异位症动物模型的构建.现代妇产科进展，2003，12(4)：262-263.

　　14 周应芳.子宫内膜异位症的临床诊断和治疗.中华妇产科杂志，2005，40(1)：67-70.

　　*基金项目：本课题受国家自然科学基金重点项目资助(课题号39830350)

　　作者单位： 100853 北京，解放军总医院妇产科