免疫失败儿童乙肝病毒S基因“a”抗原决定簇序列分析

作者：虞勤, 刘玉琴， 王永忠， 江剑华    作者单位：常州市第三人民医院妇产科， 江苏 常州 213001 【摘要】  目的： 探讨乙肝疫苗联合高效价乙肝免疫球蛋白母婴阻断免疫失败儿童病毒S基因“a”决定簇的变异情况。方法： 对30例经乙肝疫苗联合高效价乙肝免疫球蛋白母婴阻断免疫失败后血清表面抗原（HBsAg）阳性的儿童，采用聚合酶链反应方法（PCR）扩增其血清中HBV DNA S基因区，并对PCR产物直接标记测序。结果： 30例HBsAg阳性儿童有28例血清HBV DNA阳性，其中有8例出现了S基因“a”决定簇的变异，变异率为28.6%，第126位的异亮氨酸（Ile）被苏氨酸（Thr）替代2例，第134位苯丙氨酸（Phe）被异亮氨酸替代2例，第145位甘氨酸（Gly）被丙氨酸（Ala）替代4例。结论： 乙肝疫苗联合高效价乙肝免疫球蛋白母婴阻断免疫失败儿童中存在S基因“a”抗原决定簇变异。

【关键词】  乙型肝炎病毒； 乙型肝炎疫苗； 高效价乙肝免疫球蛋白； 变异； 基因

Sequence analysis on HBV DNA “a” determinant mutationin children failed in HBIG vaccination

　　YU Qin, LIU Yuqin, WANG Yongzhong, JIANG Jianhua

　　(Department of Obstetrics and Gynecology, the Third People′s Hospital of Changzhou, Changzhou Jiangsu 213001, China)

　　［Abstract］Objective: To investigate hepatitis B virus(HBV) S gene “a” determinant mutation in  children who failed to be protected by hepatitis B vaccine and hepatitis B immune globulin.Methods： HBV DNA S gene was amplified by polymerase chain reaction and sequenced directly. Results： There were 28 samples for HBV DNA positive in all children with HBsAg positive, eight mutations were detected, the mutation rate was 28.6%;two strain showed IletoThr at the 126 codon of surface antigen, two strain showed PhetoIle at the 134 codon, and four strains showed GlytoAla at the 145 condon of surface antigen. Conclusion： HBV S gene “a” determinant mutation existed in HBV vaccination and Hepatitis B immune globulin immune failure children.

　　［Key words］Hepatitis B virus;  Hepatitis B vaccine;  Hepatitis B immune globulin;  S gene mutation; gene

    乙型肝炎病毒的母婴传播是乙型肝炎病毒感染的重要途径之一。随着乙型肝炎疫苗和高效价乙肝免疫球蛋白的广泛应用，乙型肝炎的发病率已明显降低，但仍有部分儿童未能通过疫苗的主动免疫和高效价乙肝免疫球蛋白的被动免疫而得到保护。母亲体内病毒的高复制水平、宫内感染以及对疫苗的低反应性都可能影响疫苗的免疫效果。近年来有关研究显示S基因“a”决定簇的变异可能也是影响疫苗免疫效果的一个重要因素。为了解乙肝疫苗联合高效价乙肝免疫球蛋白免疫失败儿童S基因“a”决定簇的变异情况，我们对接种过乙肝疫苗联合高效价乙肝免疫球蛋白的30例表面抗原阳性儿童“a”决定簇进行了序列分析，现将结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  对象

    入组儿童共30例，均为2005年1月至2006年1月在我院分娩。因其母乙肝血清学检查中HBsAg，HBeAg和HBcAb均为阳性，且HBVDNA阳性。孕期26周，31周，36周分别注射高效价乙肝免疫球蛋白200 U，进行宫内母婴阻断。30例儿童在出生后的脐血HBVDNA均为阳性，出生后24 h内及1月，3月，6月分别进行乙肝疫苗联合高效价乙肝免疫球蛋白进行预防免疫，经跟踪随访，出生后3岁体检HBsAg仍为阳性。其中，男16例，女14例，体检肝功能正常，无临床肝炎症状，血清分离后，-80°C冻存。    　　1.2 主要仪器和试剂      　　ABI PRISM310型核苷酸序列分析仪、PE9600型基因扩增仪、ABI5700型荧光定量PCR系统（美国ABI公司产品）。Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP由上海生工公司提供，末端标记试剂BigDye为ABI公司产品，PCR产物纯化试剂盒为Qiagen公司产品。

    1.3 引 物

    由上海生工公司合成，P1：5′TCC CAT CTC TCC ACC TCT AA3′，P2: 5′CAT GAA GTT AAG GGA GTA GCC3′，P3: 5′TCT AGA CTC GTG GTG GAC TT3′，P4: 5′CCC CAA TAC CAC ATC ATC CA。其中P1/P2为外引物，P3/P4为内引物，引物浓度为25 pmol/μl,测序引物为P3。

    1.4 样本处理     　　血清中HBV DNA提取采用SiO2吸附法，取血清50  μl 加入含异硫氰酸胍和吸附剂的离心管中，振摇5 s，室温放置20 min，10 000r/min离心30 s，弃上清，洗涤2次，加入30  μl 核酸洗脱液，混悬后94℃加热5 min，再振摇5 s，10 000 r/min离心30 s后的上清液即可用作PCR反应的模板。

    1.5 基因扩增     　　第一轮PCR，采用50  μl 反应体积，其中模板10  μl，10×PCR缓冲液 5  μl，25 mmol/L MgCl2 4 μl，Taq酶0.5 μl，引物P1/P2各1  μl，10 mmol/L dNTP 1  μl，ddH2O 37.5 μl 。反应条件：94℃ 5 min后，94℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃ 50 s，循环30次，再72℃延伸5 min。第二轮PCR采用50 μl 反应体积，其中第一轮PCR产物2.5 μl，10×PCR 缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 4 μl，Taq酶0.5 μl，引物P3/P4各1 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，ddH2O 35 μl ；反应条件：94℃ 5 min后，94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 1 min，循环30次，再72℃延伸5 min。    　　1.6 PCR产物纯化及末端标记         　　PCR产物纯化用Qiagen柱纯化试剂盒，操作按说明书进行，纯化后的PCR产物用30  μl  ddH2O溶解，末端标记采用5 μl 反应体积，其中模板1 μl，BigDye反应混合物1 μl，P3 1 μl，ddH2O 2 μl，反应条件：96℃ 2min后，96℃ 15 s，55℃ 10 s，60℃ 4 min，循环26次。

    1.7 测序产物的纯化和测序前准备

    测序产物纯化采用醋酸乙醇沉淀法，测序产物中加入2 μl 的3 mol/L NaAc和50 μl 无水乙醇，混匀后冰浴20 min，14 000 r/min离心25 min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤1次，自然干燥后，加入25 μl 模板溶解液，混匀后96℃热变性3 min，迅速冰浴5 min。

    2  结 果

    2.1  HBV DNA检测及亚型分析

    30例表面抗原阳性儿童中有28例血清HBV DNA阳性，阳性率为93.3%。根据基因组S区122及160位点氨基酸类型进行血清亚型分析，28例儿童感染乙肝病毒均为ad血清型，其中adw亚型12例，占42.9%；adr亚型16例，占57.1%。

    2.2  乙肝病毒S基因“a”决定簇序列分析

    28例儿童所测基因序列翻译为相对应的氨基酸序列后发现有8例儿童血清HBV DNA S基因“a”决定簇氨基酸发生了变异,分别为编码第126位密码子的ATT→ACT突变导致Ile Thr 替换, 编码第134位密码子的TTT→ATT突变导致PheIle替换，编码第145位密码子的GGA→GCA突变导致Gly Ala替换。

    3  讨 论

    乙型肝炎病毒S基因“a”抗原决定簇是乙型肝炎病毒各亚型的共有抗原决定簇, 根据基因组S区122及160位点氨基酸类型可将乙肝病毒分为4种亚型(adw，adr，ayw，ayr)。在我国各种亚型均有报道,并有文献报道由南向北adw 亚型的比例逐渐降低［1-3］。我们对30例表面抗原阳性儿童血清进行了HBV DNA检测,有28例儿童HBV DNA阳性,占93.3%,说明乙肝疫苗联合高效价乙肝免疫球蛋白免疫失败儿童多数存在病毒的复制,进一步对HBV DNA阳性的儿童病毒S基因测序后发现,存在adw和adr两种亚型,其中adw亚型12例，占42.9%；adr亚型16例，占57.1%。

    S基因“a”抗原决定簇是由24个氨基酸通过2个二硫键组成的双环结构,针对此决定簇的抗体对乙肝表面抗原均可结合并具有中和作用,因而可以有效地保护机体免受各亚型病毒的感染。但“a”抗原决定簇氨基酸的变异可能会影响疫苗的免疫效果,已有文献报道在疫苗免疫失败者中发现“a”抗原决定簇变异株［4-6］,其中国外报道［4］的最常见的变异是第145位的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)所替代，还有141位的赖氨酸(Lys)被谷氨酸(Glu)所替代，以及第144位的天冬氨酸(Asp)被丙氨酸(Ala)所替代，这三个位点都在“a”抗原决定簇的第2环。国内文献［3］报道了126位异亮氨酸(Ile)可以被缬氨酸(Val)或苏氨酸(Thr)所替代，133位甲硫氨酸(Met)可以被亮氨酸(Leu)替代，并认为“a”抗原决定簇的第1环是变异高发位点。我们对江苏常州地区的30例乙肝疫苗联合高效价乙肝免疫球蛋白免疫失败儿童的血清HBV DNA S基因“a”抗原决定簇分析后发现8例儿童存在“a”抗原决定簇变异，其中2例为第126位的异亮氨酸（Ile）被苏氨酸（Thr）替代，并发现了1例编码第134位密码子的TTT→ATT突变而导致了苯丙氨酸(Phe)被异亮氨酸(Ile)替换，这一位点的变异尚没有文献报道，为S基因“a”抗原决定簇变异的新类型。有4例出现了第145位氨基酸的变异，但都不是文献报道的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)所替代，而是甘氨酸(Gly)被丙氨酸(Ala)所替代。 “a”抗原决定簇的第1环和第2环各有4例发生了变异。由此可见，乙型肝炎病毒S基因“a”抗原决定簇的变异存在着地区性的差异,对乙型肝炎病毒S基因“a”抗原决定簇的变异进行地区性研究依然有着重要的意义。

【参考文献】  　　［1］范金水,庄 辉,李远贵,等.我国八城市HBsAg阳性和阴性乙肝患者的病毒血清型和基因型分析［J］.中华微生物和免疫学杂志,1998,18(2):88-91.

　　［2］付海军,李荣成,马景成,等.接种乙型肝炎疫苗后HBsAg携带者病毒基因S区“a”决定簇变异［J］.中华传染病杂志,2002,20(1):17-20.

　　［3］徐陈槐,黄晓燕,刘克洲,等.乙型肝炎疫苗母婴阻断失败与乙型肝炎病毒S基因变异［J］.中华传染病杂志,2002,20(1):33-36.

　　［4］Carman WF, Zanetti AR, Karayiannis P, et al.Vaccineinduced escape mutant of hepatitis B virus［J］.Lancet,1990,336(8711):325-329.

　　［5］He JW, Lu Q, Zhu QR, et al.Mutations in the “a”determination of hepatitis B surface antigen among Chinese infants receiving active postexposure hepatitis B immunization［J］.Vaccine, 1998,16（2）:170-173.

　　［6］Ni F, Fang D, Gan R, et al.A new immune escape mutant of hepatitis B virus with an Asp to Ala substitution in aa 144 of the envelope major protein［J］.Res Virol,1995,146（6）:397-401.