PTEN和p53蛋白异常表达与子宫内膜异位症恶变的关系

作者：马小平，甄宗慧，徐冰，戴淑真，赵鹏，魏志敏    作者单位：1.青岛大学医学院附属医院妇科，山东 青岛 266003；2． 滕州市工人医院妇产科，山东 滕州 277500； 3. 青岛大学医学院附属医院病理科，山东 青岛 266003 【摘要】  目的 探讨PTEN基因和p53基因蛋白表达异常与子宫内膜异位症（简称内异症）恶变的关系以及两者在其发生发展过程中的相互作用。方法 应用免疫组化PV9000二步法检测23例内异症相关卵巢癌(EAOC)、10例不典型内异症(aEMs)和20例典型卵巢内异症(EMT)组织中PTEN和p53基因蛋白表达情况。结果 EAOC中PTEN、p53基因蛋白表达缺失率分别为78.26%和17.39%，前者高于EMT组(5%)和aEMs组(20%)，后者低于EMT组(85%)和aEMs组(70%)。EAOC中PTEN、p53基因蛋白表达缺失率与EMT组相比差异有高度统计学意义(P＜0.01)，与aEMs组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。EAOC中PTEN、p53基因蛋白表达缺失率均与临床分期、病理分级、是否伴有转移密切相关(P＜0.05)，与年龄、组织学类型无关(P＞0.05)，不同的是，PTEN在临床分期早、组织分化好、无转移的EAOC中的蛋白表达缺失率明显低于临床分期晚、组织分化差和(或)伴转移者，而p53蛋白表达相反。PTEN和p53基因的蛋白表达呈负相关。结论 PTEN蛋白表达缺失和p53蛋白过表达与内异症相关卵巢癌及内异症恶变的发生发展密切相关。

【关键词】  子宫内膜异位症；卵巢肿瘤；不典型增生；PTEN基因；p53基因；免疫组化

    Correlation of the protein expression of PTEN and p53

    with malignant transformation of endometriosis

    MA Xiaoping, ZHEN Zonghui, XU Bing, DAI Shuzhen, ZHAO Peng, WEI Zhimin

    (Dept. of Gynecology, Affiliated Hospital of Qingdao University) 

    Abstract:Objective: To investigate the relationship between protein expressions of PTEN and p53 genes and malignant transformation of endometriosis. Methods: Twentythree endometriosis associated ovarian cancers (EAOC), 10 atypical hyperplasia endometriosis of ovary and 20 typical endometriosis tissues were used to detect the protein expressions of PTEN and p53 genes using immunohistochemistry PV9000 method. Among the twentythree EAOC samples, nine were endometrioid carcinomas, fourteen were clear cell carcinomas, and four of them demonstrated continuity between cancer and endometriosis tissue. Results: Eighteen of the twentythree EAOC cases (78.26%) and four (17.39%) had PTEN and p53 protein expression deletion, with the deletion rates of PTEN higher and p53 lower than those of EMT and aEMs respectively. The protein expression deletion rates of PTEN in EMT and aEMs were 5% and 20%, but those of p53 were 85% and 70% respectively. There was significantly difference when EAOC was compared with EMT or aEMs (P＜0.05). The rates of protein expression of PTEN/p53 of EAOC were not relative to age difference and histological type (P＞0.05), and but had significant relationship with clinical stage, pathological grade or accompanied metastasis (P＜0.05). The rate of protein expression deletion of PTEN of EAOC which was in early clinical stage, welldifferentiated and not accompanied by metastasis was obviously lower than that which was in late clinical stage, poordifferentiated and accompanied metastasis. However, there was an opposite expression of p53. Obviously, it was negtively correlated with the protein expression of PTEN and p53. Conclusion: There is intimate correlation between aberrant expressions of PTEN and p53 genes and malignant transformation of endometriosis.

    Key words:endometriosis; ovarian neoplasms; atypical hyperplasia; PTEN Gene; p53 gene; Immnohistochemistry

    子宫内膜异位症(Endometriosis, EMT)是指具有活性的子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫内膜以外部位，属良性疾病，却具有与恶性肿瘤相似的生物学行为。目前临床上时有见到恶变病例，且发现卵巢子宫内膜样癌和透明细胞癌是最常见的恶变病理类型。本研究拟联合检测PTEN和p53基因的蛋白表达情况，以探讨其与内异症恶变的关系以及在恶变不同发展阶段发挥的作用。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源

    收集1992年4月至2007年10月在青岛大学医学院附属医院和青岛市市立医院手术治疗的病理标本53例。（1）有内异症病史或合并内异症的内异症相关卵巢癌(Endometriosis associated ovarian cancer, EAOC)组织23例［包括卵巢子宫内膜样癌(Endometrioid carcinoma, EEC) 9例，透明细胞癌(Clear cell carcinoma,CC) 14例］，23例中4例符合Sampson和Scott［1,2］内异症恶变诊断标准；（2）不典型内异症(Atypical endometriosis, aEMs)组织10例。33例患者年龄38～66岁，中位年龄52.5 岁；（3）新鲜卵巢内异症(EMT)标本20例，患者年龄28～40岁，中位年龄34.2 岁。所有患者术前均未接受放射治疗、化学药物治疗及激素治疗，标本均经术后病理证实。卵巢癌按临床分期分为I、II、III期，按组织学分级分为G1、G2、G3。所有蜡块制备4 cm厚连续切片4张，1张行HE染色，余3张行免疫组化染色。

    1.2  主要试剂

    鼠抗人PTEN、p53单克隆抗体(即用型)、PV9000通用型免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。

    1.3  实验方法

    PV9000二步法。用已知阳性的乳腺癌切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。实验步骤按照试剂盒说明书进行。

    1.4  结果判断

    阳性表达以胞浆(PTEN)或胞核(p53)内是否出现明显的棕色颗粒为判断标准。高倍显微镜下观察10个视野计数，计算其阳性表达的百分率。⑴弱阳性(+)：阳性细胞＜25%；⑵阳性(++)：阳性细胞为25%～50%；⑶强阳性(+++)：阳性细胞＞50%。阴性(-)：瘤细胞无棕色或显示与背景一致的浅棕色。

    1.5  统计学处理

    应用SPSS 13.0统计分析软件处理数据。计数资料用相对数表示。组间比较采用χ2检验。相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  PTEN基因、p53基因在EMT、aEMs、EAOC组织中的蛋白表达

    EMT与aEMs组织中PTEN、p53基因蛋白表达缺失率差异无统计学意义。EAOC组织中PTEN、p53蛋白表达缺失率分别为78.26%和17.39%，与aEMs组相比，差异均有统计学意义(χ2=7.619，6.474；P=0.006，0.011)，与EMT相比，差异均有高度统计学意义(χ2=23.281，19.570；P=0.00，0.00)。PTEN、p53基因在各组织中的蛋白表达强度分级和EAOC中PTEN、p53基因蛋白表达缺失与临床病理特征的关系分别见表1、表2。23例EAOC组织PTEN、p53基因蛋白表达缺失率与临床分期、病理分级、是否伴有转移密切相关(P＜0.05)，与年龄、组织学类型无关(P＞0.05)。临床分期早、组织分化好、无转移的EAOC组织的PTEN蛋白表达缺失率明显低于临床分期晚、组织分化差和(或)伴转移者，而p53蛋白在临床分期晚、组织分化差和(或)伴有转移的病例中出现过表达。表1  PTEN、p53基因蛋白在各组中的表达表2  PTEN和p53基因蛋白表达及与EAOC临床病理特征的关系*EAOC和EMT组间比较；#EAOC和aEMs组间比较

    2.2  EAOC中PTEN与p53基因蛋白表达的相互关系

    19例p53染色阳性的标本中，2例PTEN染色阳性，17例染色阴性；4例p53染色阴性的标本中，3例PTEN染色阳性，1例阴性(见表3)。经统计学检验，二者呈负相关(rs=-0.593，P=0.003)。表3  EAOC组织中PTEN和p53基因蛋白表达的关系注：Spearman等级相关系数，rs=-0.593，P=0.003。

    3  讨  论

    3.1  子宫内膜异位症及其恶变

    子宫内膜异位症虽是常见的妇科良性疾病，但有浸润、粘连、种植、远处转移等恶性生物学行为［3］，存在恶变倾向(恶变率0.7%～1.6%)［4］，恶变最常发生在卵巢(80%)［5］。在良性内异症恶性转化的过程中，aEMs是极为重要的中间环节，内异症经历典型内异症—不典型增生—恶变的恶性转化过程［68］。

    内异症恶变的诊断参照Sampson和Scott标准：(1)在同一卵巢中,内异症和癌并存；(2)内异症和癌的组织学关系相类似；(3)除外转移性恶性肿瘤；(4)镜下可见异位内膜与癌组织相连，有良性内异症向恶性过渡的组织形态。该诊断需要确切的病理学依据。而恶变过程中癌组织可能会消除原有的内异症的病理学证据，病理取材过程中的局限性也使得临床报道的内异症发生率远远低于实际发生率。

    　　现有的组织学和流行病学证据表明，内异症和卵巢癌存在一定关系，在8%～30%的卵巢癌中合并内异症的存在［9］。本研究选取内异症相关卵巢癌病例进行研究。目前有关PTEN和p53基因蛋白表达异常与内异症及卵巢癌的研究较多见，但有关内异症恶变的系统研究少见报道且结论不一。本研究旨在联合检测PTEN和p53基因的蛋白异常表达情况，探讨其与内异症恶变发生发展的关系。

    3.2  PTEN基因、p53基因蛋白表达异常与内异症恶变

    PTEN是第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因［10］，其中基因突变是最常见的基因失活方式，蛋白表达水平下降是恶性肿瘤发生的早期事件［11］。

    本研究结果发现，PTEN蛋白在EMT、aEMs、EAOC组织中均有表达，表达强度逐渐降低，EAOC组与EMT组PTEN蛋白表达缺失率差异有高度统计学意义(P＜0.01),提示PTEN作为肿瘤抑制基因，其功能的失活与内异症相关卵巢癌及内异症恶变的发生有明显的关系，其蛋白表达水平的下降可被视为EMT恶性转化的标志之一。研究显示，PTEN蛋白表达缺失与EAOC的组织学类型无关，即各种组织类型均有表达缺失，且缺失程度没有明显差异，故用于鉴别EAOC的组织类型没有意义。同时发现，PTEN蛋白表达缺失与临床分期、病理分级、是否伴有转移有关，分期早、组织分化好、不伴转移者缺失率低于分期晚、组织分化差和伴转移者，因此PTEN蛋白表达水平下降可作为内异症相关卵巢癌发生或内异症恶变早期诊断的一个分子标记物。

    野生型p53(wtp53)半衰期短，通过免疫组化方法难以检测，常规检测到的几乎均是突变型p53(mtp53)。p53基因突变或无功能性p53蛋白过表达是迄今卵巢癌中尤其是浆液性肿瘤中最常检测到的基因改变类型［12］。

    本研究结果发现，p53蛋白在EMT、aEMs、EAOC组织中均有表达，且表达强度明显增加。EAOC组与EMT组p53蛋白表达缺失率差异有高度统计学意义(P＜0.01),提示p53蛋白过表达与内异症相关卵巢癌的发生有明显的关系，p53可作为EMT到aEMs再到癌恶性转化过程中的连续性信号。同时发现，p53蛋白表达缺失与临床分期、病理分级、是否伴有转移有关，分期早、分化好、不伴转移者缺失率高于分期晚、分化差和伴转移者，p53蛋白过表达可作为EAOC早期诊断的一个辅助指标。

    3.4  PTEN和p53基因蛋白表达异常在内异症恶变发生发展过程中的相互作用

    本研究表明，EAOC中PTEN和p53的蛋白表达呈负相关(r=-0.593，P=0.003)，提示p53与PTEN在抑制肿瘤发生发展方面存在互补作用。Wtp53和PTEN均是抑癌基因，且p53基因可以增加PTEN的表达，本研究发现PTEN基因在EAOC中的表达显著降低，而p53基因在EAOC中的表达显著增高，似乎有些矛盾。但我们检测到的为mtp53，wtp53突变后对PTEN的诱导作用消失，PTEN的表达减低，故mtp53与PTEN二者呈负相关。另外，病理取材的限制性以及切片过程中遗漏癌变突出部位都有可能导致阴性结果，有待于扩大样本量或改进实验方法做更深入研究。

    综上所述，PTEN和p53可作为内异症恶变过程中的分子标记物，与内异症恶变的发生发展密切相关，联合检测PTEN和p53的蛋白表达水平将有助于内异症恶性转化的监测、诊断以及预后的评估。

【参考文献】  ［1］ Sampson J A. Endometrial carcinoma of the ovary, arising in endometrial tissue in that organ［J］. Arch Surg, 1925, 10: 172.

［2］ Scott R B. Malignant changes in endometriosis［J］. Obstet Gynecol, 1953, 2: 283289.

［3］ Ness RB. Endometriosis and ovarian cancer: thoughts on shared pathophysiology［J］. Am J Obstet Gynecol, 2003, 189: 280294.

［4］ Rajesh V, Terrance R, Janesh K, et al. Endometriosis and the neoplastic process［J］. Society for Reproduction and Fertility, 2004, 127: 293304.

［5］ 冷金花, 郎景和. 子宫内膜异位症恶变的研究现状［J］. 实用肿瘤杂志, 2006, 21(6): 494495.

［6］ Jiang X, Morland SJ, Hitchcock A, et al. Allelotyping of endometriosis with adjacent ovarian carcinoma reveals evidence of a common lineage［J］. Cancer Research, 1998, 58: 17071712.

［7］ Dinulescu DM, Ince TA, Quade BJ, et al. Role of Kras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer［J］. Nat Med, 2005, 11: 6370.

［8］ Sato N, Tsunoda H, Nishida M, et al. Loss of heterozygosity on 10q23.3 and mutation of the tumor suppressor gene PTEN in benign endometrial cyst of the ovary: possible sequence progression from benign endometrial cyst to endometrioid carcinoma and clear cell carcinoma of the ovary［J］. Cancer Res, 2000, 60: 70527056.

［9］ Nakako S, Hajime T, Masato N. Loss of heterozygosity on 10q23.3 and mutation of the tumor suppressor gene PTEN in benign endometrial cyst of the ovary: possible sequence progression from benign endometrial cyst to endometrioid carcinoma and clear cell carcinoma of the ovary［J］. Cancer Res, 2000, 60(24): 70527056.

［10］ L IDM. SUN H1 TEP1, encoded by a candidate tumor suppressor locus, is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta ［J］. Cancer Res, 1997, 57(11): 2124221291.

［11］ Georgescu MM, Kirsch KH, Akagi T, et al. The tumor suppressor activity of PTEN is regulated by its carboxyl terminal region［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1999, 96(18): 1018210187.

［12］ Schuijer M and Berns EM. TP53 and ovarian cancer［J］. Hum Mutat, 2003, 21: 285291.