多囊卵巢综合征患者颗粒细胞中抑制素亚基及卵泡抑素mRNA的表达意义

    作者：陈小平 柏刚 高晓晴 陈艳 李洁华    作者单位：盐城 江苏省盐城市第一人民医院

    【摘要】  目的 检测多囊卵巢综合征(PCOS)患者与正常妇女颗粒细胞中inhibin α(INHα)、inhibin β A(INHβA)、INHβB亚基 、FS 315 及FS 288的表达水平，探讨上述细胞因子与PCOS发病的关系。方法 PCOS患者20名作为研究组，非PCOS妇女30名作为对照组，采用定量竞争性逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测两组妇女颗粒细胞中INHα、INHβA、INHβB亚基、FS 315及FS 288的表达水平。结果 PCOS组妇女颗粒细胞中INHβα、INHβA、INHβB亚基、FS 315及FS 288的相对表达水平分别为0.93±0.41、3.72±1.08、0.88±0.27、0.81±0.16、0.29±0.09。正常对照组妇女颗粒细胞中上述指标的相对表达水平分别为0.88±0.37、1.96±0.68、0.65±0.26、0.45±0.12、0.18±0.07。两组各项指标相比均有显著差异。正常妇女体内，颗粒细胞α亚基mRNA水平和卵泡直径正相关(r=0.63;P＜0.01)。颗粒细胞INHβA亚基和卵泡直径正相关(r=0.45；P=0.05)。且α和βA亚基mRNA水平正相关(r=0.91; P＜0.001)。而βB亚基mRNA水平与卵泡直径无相关性。βB亚基mRNA水平较βA亚基mRNA水平低10倍。在PCOS患者中，颗粒细胞INHβα、INHβA、INHβB亚基mRNA水平与卵泡直径无相关性。在PCOS颗粒细胞中，稳态FS 315及FS 288 mRNA水平与卵泡直径及无相关性，无论正常妇女还是PCOS者的卵泡中，这两种转录产物自身却高度相关(r=0.85;P<0.001和r=0.99;P<0.001)。另外，正常妇女和PCOS者FS 315/FS 288的比率相同(平均2.98±1.2 和2.90±1.2)，并不因卵泡直径而改变。结论 INHα和INHβA在卵泡的生长发育中起着重要作用。PCOS者INHα和βA亚基mRNA功能有缺陷。

    【关键词】  多囊卵巢综合征； 抑制素； 卵泡抑素

    The Significance of Expressing the Inhibin Subunit and Follistatin mRNA in the Granular Cells from the Patients with the Polycystic Ovary Syndrome   CHEN Xiaoping,BAI Gang, GAO Xiaoqing,et al.Department of Obstetrics and Gynecology,The First People Hospital of Yancheng，Yancheng  224001,China

    【Abstract】  Objective  To further explore the expression of the  inhibin α(INHα),inhibin β A(INHβA),INHβB unit,FS 315 and FS 288 in the Granular Cells from the patients with the Polycystic Ovary Syndrome(PCOS)and the normal women and investigate the invasive relation between cytokines and PCOS. Methods  20 patients with PCOS were regarded as the research group and 30 women without PCOS as the control group. Quantitative competitive RTPCR assays were established to detect the expression of the INHα,INHβA,INHβB subunit,FS 315 and FS 288 in the Granular Cells from the women of the two groups. Results  The expressing level of INHβα,INHβA,INHβB subunit,FS 315 and FS 288 in the Granular Cells from the patients with PCOS were 0.93±0.41,3.72±1.08,0.88±0.27,0.81±0.16,0.29±0.09 and the control group were 0.88±0.37,1.96±0.68,0.65±0.26,0.45±0.12,0.18±0.07.There were significant deviation in every index of the two groups. In the control group, the α subunit mRNA levels in the GrC increased significantly with follicle diameter (r=0.63;P<0.01), the INHβA subunit mRNA levels in the GrC increased significantly with follicle diameter(r=0.45；P=0.05).The level of α and βA subunit showed direct correlation (r=0.91; P＜0.001) while the level of βB subunit mRNA showed no correlation with follicle diameter. But βB subunit mRNA levels,were at least 10 fold lower than levels of the other subunits. Among the patients with PCOS, the level of mRNA of INHβα,INHβA,INHβB subunit showed no relationship with follicle diameter.The GrC of the patients with PCOC the level of homeostasis FS 315 and FS 288 showed no dependability with the follicle diameter. In the egg chambers of the normal women and patients with PCOS, the two transcripts correlated highly(r=0.85; P<0.001 和r=0.99;P<0.001). In addition, the ratios of FS 315 to FS 288 in the normal women and the patients with PCOC which didn’t change with follicle diameter were identical(average 2.98±1.2 and 2.90±1.2).Conclusion  INHα and INHβA play an important role in the growth of egg chamber. The INHα and βA subunit mRNA of the patients with PCOS have function defects.

    【Key words】  Polycystic ovary syndrome;Inhibin;Follistatin

    抑制素和卵泡抑素是重要的糖蛋白激素，研究发现，通过局部的自分泌或旁分泌作用调节卵巢功能。它们与多囊卵巢综合征(PCOS)关系的研究也越来越受到人们的重视。本文通过测定PCOS患者与正常妇女颗粒细胞中inhibin α(INHα)、inhibin β A(INHβA)、inhibin β B(INHβB)亚基、FS 315及FS 288的表达水平，探讨它们与PCOS发病的关系。

    1  资料和方法

    1.1  研究对象  ①PCOS组：选择2005年10月～2007年8月在盐城市第一人民医院就诊的PCOS患者20名，共79个经阴道穿刺抽吸的卵泡，平均直径7.1 mm(5.0～9.1 mm)；年龄(29.3±11.8)岁；本组患者在其他方面均健康，实验前3个月未服药，每年月经少于7次，每位患者都经至少2次B超和10次采血证实其缺乏卵泡成熟和月经的周期性。②对照组：同期就诊的无内分泌因素体外授精(IVF)不孕患者30名，年龄(28.1±9.4)岁，共91个经阴道穿刺抽吸的自然成熟的卵泡，平均直径12.9 mm(6.4～23 mm)。该组受试者月经周期26～32 d，研究前3个月未服药物，公二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)、睾酮(T)、促甲状腺激素(TSH)、泌乳素(PRL)水平及体格检查正常，在一个完整的月经周期内抽血，超声监视卵泡生长，吸取任一侧卵巢的优势卵泡。两组研究对象年龄比较差异无统计学意义 (P>0.05)。

    1.2  标本采集和检测

    1.2.1  颗粒细胞的收集与处理  颗粒细胞取自盐城市第一人民医院和苏州大学附属第一医院行IVF的妇女卵泡穿刺。测卵泡体积，卵泡液予冰冻，颗粒细胞迁入塑料培养皿，筛选颗粒细胞于PBS液(英格兰BRL生物技术公司提供)中洗涤3遍，置入1.5 ml，离心机3 000转/min离心5 min，去上清液。以50%硅石胶态悬浮液(Sigma公司)分离去除红细胞。将用于RTPCR的颗粒细胞置于1 ml TRIzol(Gibco公司)和5 μg大肠埃希菌tRNA(均来自英格兰BRL生物技术公司)，标本置入-80℃冰柜直至抽提RNA，从样本提取到完成的整个时间为1～1.5 h。

    1.2.2  RNA抽提  以TRIzol法抽提颗粒细胞RNA，RNA在10～15 μl的焦碳酸二乙酯水溶液中，5 μl的RNA以去氧核糖核酸酶(BRL生物公司)在10 μl的反应体系中处理15 min，然后用100 U的SuperscriptⅡ(BRL生物公司)，在21.5 μl的反应体系中42℃反转录50 min，加入核糖核酸酶H(1.5 U,BRL公司)，样本在37℃孵化20 min，直至酶灭活，在PCR前逆转录反应以1∶10水稀释。

    1.2.3  RTPCR技术  PCR 反应体系由10×PCR缓冲液10 μl, 4×dNTP (各200 μmol/L ) 215 Ll, 各引物10 pmol, 模板DNA 2 μg, Taq DNA聚合酶 2.5 U, Mg2+ 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至100 μl组成。反应条件：预变性94℃ 5 min, 热循环94℃ 30 s, 58℃ 30 s,72℃ 30 s (共38 个循环) , 终末延伸72℃ 10 min。RT-PCR 扩增产物以2% 琼脂糖凝胶、100 V 电压电泳, 30～50 min 在紫外线投射仪上观察, 并与PCR 标准相对分子量比较。凝胶摄像后用图像处理系统计算其吸光度(A)×面积值, 与内参照相比较计算其比值。

    1.2.4  引物设计  RTPCR反应所用引物均由上海晶美生物工程公司合成，PAGE级纯度，引物及预期产物大小见表1。

    2  统计学处理

    所得数据以±s表示，使用SPSS 15.0统计软件包进行t检验，Spearman相关性分析。

    3  结果

    两组妇女颗粒细胞中INHβα、INHβA、INHβB亚基、FS 315 及FS 288的相对表达水平分别见表2，两组各项指标相比均有显著差异，PCOS患者上述指标均显著升高。 正常妇女体内，颗粒细胞α亚基mRNA水平和卵泡直径正相关(r=0.56; P＜0.01)。颗粒细胞INHβA亚基和卵泡直径正相关(r表1  INH的α亚基、βA、βB亚基、FS 288、FS 315 mRNA的上下游引物及预期产物长度 =0.45; P=0.05)。且α和β亚基mRNA水平正相关(r= 0.91;P＜0.001)。而βB亚基mRNA水平与卵泡直径无相关性。βB亚基mRNA水平较βA亚基mRNA水平低10倍。在PCOS患者中，颗粒细胞INHα、INHβA、INHβB亚基mRNA水平，FS 315及FS 288 mRNA水平与卵泡直径无相关性。无论正常妇女还是PCOS者的卵泡中，这两种转录产物自身都高度相关(r=0.85; P< 0.001 和r=0.99; P<0.001)。另外，正常妇女和PCOS者FS 315/FS 288的比率相同(平均2.98±1.2和2.90±1.2)，并不因卵泡直径而改变，见表2及图1。表2  INHα、INHβA、INHβB、FS 315、FS 288在卵巢颗粒细胞中的 表达水平(灰度值比)注：与对照组比较，*P<0.01；与对照组比较，**P<0.05

    4  讨论

    4.1  INH与FS的结构特征和生物学功能  近年来，卵巢局部微调节在卵泡生长发育中的作用越来越受到关注，这些物质共同调节卵泡由始基、初级、次级卵泡至成熟优势卵泡这个有序的过程。已知卵巢内合成的局部调节因子包括胰岛素样生长因子(IGF)系统，转化生长因子β(TGFβ)超家族(INH，FS即属于它们其中的一员)等。INH和FS均是糖蛋白激素，INH由a亚基和βA、βB亚基连接形成INHA(aβA)和INHB(aβB)两种形式。βA和βB亚基多肽前体由不同的基因编码。循环中的INH主要来源于性腺，颗粒细胞是卵巢中分泌INH的主要场所，再通过血循环对垂体合成和分泌FSH产生负反馈作用。FS富含半胱氨酸，由单个基因编码。INH和FS通过自分泌或旁分泌作用调节颗粒细胞的增殖和分化。

    人外周血INH水平随月经周期变化：INHA在卵泡早期最低，随优势卵泡发育，卵泡晚期明显升高，在黄体期达最高水平，随后在黄体卵泡转换期(卵泡募集期)迅速下降；INHB在卵泡早期即已上升，在卵泡中期达最大值，之后稍有下降，在月经中期又呈小的峰值，黄体期迅速下降［1］。INH抑制垂体产生FSH，推测黄体-卵泡转换期INHA下降诱发了FSH小峰，对卵泡募集有重要作用，卵泡中期较高血INHB水平可能通过对FSH的降调节参与了优势卵泡的选择和非优势卵泡的闭锁。窦前卵泡无INHA的分泌，不过INHA与INHB一样可由小窦状卵泡分泌，但它的出现比INHB晚。

    4.2  颗粒细胞中INH和FS对卵泡生长的调节  INH是重要的调节蛋白，INH对垂体合成及释放FSH产生负反馈作用，并能直接刺激卵泡膜细胞合成雄激素。动物实验证实，生长卵泡中的INH对垂体分泌FSH产生降调节作用［2］。PCOS患者往往存在多个窦状卵泡同时发育，而INH主要由窦状卵泡的颗粒细胞分泌［3］。

    垂体细胞培养液中INHA和对FSHB的合成分泌也有负调节作用，这种负反馈作用在人和灵长类动物体内已得到直接证实［4］。在恒河猴卵泡期和黄体期，抑制素抑制FSH的合成分泌，对E2调控是独立的。抑制素通过旁分泌刺激LH 产生，间接使卵泡内膜细胞合成雄激素增多。

    在本研究中，我们观察到随着卵泡生长，α和βA亚基mRNA水平逐步升高。相反，βB亚基mRNA水平与卵泡生长成熟无关，这支持一种理论，即INH的α和βA亚基在卵泡的生长发育中的确起着很关键的作用：在PCOS患者，卵泡颗粒细胞分泌的INH增多，通过降调节抑制了FSH的分泌，从而又阻碍了卵泡的进一步发育成熟，并且增多的INH刺激卵泡膜细胞合成了过多的雄激素，直接抑制卵泡生长。所以在PCOS患者，增高的INH影响卵泡发育成熟，导致不排卵。而在正常女性，颗粒细胞分泌的INH还不足以产生对FSH的降调节作用，所以它的卵泡发育不受影响。

    我们还发现，正常妇女体内，颗粒细胞α亚基和βA亚基mRNA水平均和卵泡直径及成熟度正相关，而βB亚基mRNA水平与卵泡直径及成熟度均无相关性，βB亚基mRNA水平较βA亚基mRNA水平低10倍，说明INHA不是影响颗粒细胞功能的主要激素。在PCOS患者上述的相关性不存在，也说明在PCOS患者α和βA亚基mRNA功能有缺陷。

    FS能直接抑制垂体前叶细胞分泌FSH，还能作为特异性结合蛋白与激活素不可逆性结合并使之失活，间接抑制FSH分泌，降低体内雌激素水平［5］。在卵巢中FS及其mRNA存在于颗粒细胞和黄体细胞，其他类型细胞中未见表达。FS mRNA在卵巢中的表达随月经周期改变。在排卵前2 d出现血FS峰值,提示FS可能与排卵时性腺轴调节有关。在大鼠动情周期中FS变化早于孕酮且两者变化相似，说明FS可能参与动情周期中孕酮的调节［6］。

    在我们此次的研究结论中，PCOS者颗粒细胞FS 315，FS 288表达均显著升高，故抑制FSH 分泌，致使卵泡发育停滞。正常妇女体内，颗粒细胞FS mRNA水平与卵泡直径及成熟度正相关，而在PCOS患者该关系不存在，也说明在PCOS患者FS亦存在功能缺陷。

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