纤维粘附素介导的卵巢癌细胞粘附耐药的实验研究

　　梁逢奇,邢　辉,翁丹卉,黄　磊,李　芳,卢运萍,马　丁 　　(华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科,武汉　430030)　　【摘要】　目的:探讨纤维粘附素(FN)介导的卵巢癌细胞与胞外基质粘附对耐药的影响,并检测细胞粘附耐药时凋亡抑制基因Survivin的表达。方法:建立FN介导的细胞粘附模型,设定为粘附耐药(FN)组,以未铺纤维粘附素接种细胞为对照(NO2FN)组。经细胞增殖实验(MTT)检测不同浓度(0.1、1.0、10.0、100.0μmol/L)紫杉醇(Taxol)对粘附耐药组和对照组细胞(A2780、SW626)生存率的影响,用流式细胞仪(FACS)检测2组细胞50μmol/L紫杉醇作用24h后的细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹法(Western blot)和流式细胞仪(FACS)检测细胞粘附耐药形成前后Survivin蛋白的表达。结果:MTT检测结果显示细胞株A2780和SW626经不同浓度的紫杉醇作用后FN组细胞生存率均明显高于NO2FN组(P均<0105)。FACS检测结果显示两株细胞FN组细胞凋亡率均明显低于N02FN组(P均<0105)。W estern blot和FACS法检测结果显示,两株细胞FN组Survivin蛋白表达均明显高于N02FN组(P<0105)。结论:纤维粘附素(FN)可能通过上调Sur2vivin的表达介导卵巢癌细胞粘附耐药。　　【关键词】　纤连蛋白类;细胞粘附耐药;紫杉属;基因,Survivin;细胞凋亡　　中图分类号:R737131　文献标识码:A　文章编号:1004-7379(2005)04-0274-03Study of cell adhesion drug resistance of ovar ain cancer m ed ia ted by f ibronectni.L iangFengqi,X ing Hu i,W eng D anhu i,et a l.D epa rmt en t of O bstetrics and Gynecology,Tong ji Hospita l,Tong ji M ed ica l College,Huazhong U n iversity of S cience and Technology,W uhan 430030　　【Abstract】　Objective:To study cell adhesion drug resistance and detect the expressionof Survivin in drug resistant ovarian cancer cell mediated by fibronectin.M ethods:Cell adhe2sion model was formed as cell adhesion drug resistance(FN)group,non2fibronectin2coated cellsas contro l(N02FN)group.B ewteen wto group s,the percentage of survival cell of the A2780 andSw626 cells exposed to taxol of different concentrations(011,110,1010,10010μmol/L)fo r 24hours was detected by M TT.The apop totic percentage of the A2780 and Sw626 cells treatedw ith taxo l of 50μmol/L fo r 24 hours was detected by FACS.The exp ression of Survivin p roteinof the A2780 and Sw626 cells was detected by W estern blot and FACS.Results:In A2780 andSw626 cell lines,the survival cell percentage of FN group was significantly higher than that ofN02FN group(P<0105),the apop totic percentage of FN group was lower than that of N02FNgroup detected by FACS(P<0105).Exp ression of Survivin of FN group was higher than that ofN02FN group.Conclusion:Fibronectin(FN)may mediate cell adhesion drug resistance by up2regulating the level of Survivin p rotein which can inhibit the apop to sis of cell treated w ith taxo.l　　【Key words】　Fibronectins;Cell adhesion drug resistance;Taxus;Genes,Survivin;Apop2tosis　　卵巢癌发现时多已届晚期。为提高5年生存率,临床常于术后辅助化疗。不规范的化疗常导致耐药性的产生。经典的耐药机制研究多集中在单个细胞。近年,一种新的耐药机制逐渐受到重视,即肿瘤微环境对耐药的影响。肿瘤微环境包括:细胞与细胞间相互粘附、细胞与胞外基质的粘附、低氧、低pH等。为探讨细胞与胞外基质(纤维粘附素fi2bronectin,FN)粘附对耐药的影响,即细胞粘附耐药(CAM 2DR)[1],我们研究了FN在卵巢癌对紫杉醇耐药中的作用,并检测了卵巢癌细胞粘附耐药形成前后Survivin蛋白的表达水平,以初步探讨其耐药机理。1　材料和方法1.1　材料来源　(1)卵巢癌细胞株A2780、SW 626由中国典型物保藏中心(武汉大学提供)本室保种并传代;(2)纤维粘附素购自Sigma公司;(3)紫杉醇(Taxol)购自美国Bristol2M yers Squibb公司;(4)Suvivin兔抗人单克隆抗体购自SantaCruz公司。1.2　方法:1.2.1　建立纤维粘附素介导的细胞粘附模型　将纤维粘附素(100μg/ml)均匀地覆盖整个孔,室温干燥后4℃冰箱保存过夜。调整细胞浓度接种卵巢癌细胞于孔板中,37℃、5%CO2培养箱孵育2h,移去未贴壁细胞后,细胞贴壁粘附则为细胞粘附模型形成,设定为粘附耐药(FN)组,以未铺纤维粘附素接种细胞为对照(N02FN)组。1.2.2　紫杉醇敏感性的检测　(1)细胞增殖实验(M TT)检测细胞增殖:实验前分粘附耐药(FN)组和对照(N02FN)组,每组设6个复孔并设空白孔作对照,将卵巢癌细胞A2780、SW 626分别接种两组的96孔板中,每孔细胞计数1×104个。两株细胞均按浓度梯度(0.1、1.0、10.0、10010μmol/L)的紫杉醇作用24h,然后,用噻唑蓝(5mg/ml)10μl作用2h,二甲基亚砜200μl作用30min,酶标仪570nm处用于测定每孔吸光度值(OD值),计算细胞存活率=(各浓度组吸光值/空白组吸光值)×100%,并绘制生存曲线;(2)流式细胞仪检测细胞凋亡:按上述方法分组后,分别将细胞A2780和SW 626接种于两组的6孔板中,各组均用浓度50μmol/L的紫杉醇作用24h后,消化并收集各组细胞,固定,过夜,调整细胞浓度,依次加入RNA酶、碘化丙啶(PI),避光保存20m in,上机检测细胞凋亡率,细胞凋亡率=(细胞凋亡数/细胞总数)×100%。1.2.3　Survivin蛋白质表达的检测　(1)流式细胞仪(FACS)检测:按上述方法分组,50μmol/L紫杉醇作用24h后,消化、收集、固定各组细胞,破膜,Survivin抗体(1∶100)4℃过夜,异硫氰酸荧光素(F ITC)标记二抗(1∶200)37℃避光孵育30min,上机检测;(2)Western Blot检测:按上述方法分组,浓度为50μmol/L紫杉醇作用24h后,消化并收集各组细胞,裂解并提取蛋白。10%SDS聚2丙烯酰胺凝胶上电泳,上样量为80μg总蛋白(蛋白质定量采用考马斯亮蓝G2250染料法),转膜,Survivin抗体(1∶500)4℃过夜。碱性磷酸酶标记的二抗(1∶500)37℃温育1h,氯化硝基四氮唑蓝/5溴224氯223吲2哚2磷酸(NBT/BC IP)系统显色30m in。1.3　统计学处理　实验数据以x±s表示,采用配对t检验。2　结　果2.1　FN组和N02FN组紫杉醇敏感性的检测比较2.1.1　细胞生存率的比较　结果显示,细胞A2780和SW626经不同浓度(011、110、1010、10010μmol/L)的紫杉醇作用后FN组细胞生存率均明显高于NO2FN组(P均<0105),见图1、图2。cμ/mol1L-1图1　不同浓度紫杉醇作用后两组A2780细胞生存率曲线cμ/mol1L-1图2　不同浓度紫杉醇作用后两组SW626细胞生存率曲线2.1.2　细胞凋亡率的比较　细胞株A2780和SW 626 FN组细胞凋亡率分别为(9180±1158)%与(11124±2131)%,明显低于N02FN组的(23126±3176)%与(26171±3153)%(P均<0105)。2.2　Survivin蛋白质表达的检测结果2.2.1　流式细胞仪(FACS)检测结果表明A2780和SW626细胞中FN组Survivin蛋白表达平均荧光强度为(67.43±3.48)%和(56.31±2.42)%,明显高于N02FN组(38.23±2.12)%和(24.98±1156)%(P均<0105)。Vo.l14,No.42.2.2　W estern B lot检测结果　A2780和SW 626细胞的FN组Survivin蛋白表达明显高于N02FN组,见图3。图3　FN组和NO2FN组中Survivin蛋白表达3　讨　论纤维粘附素是高分子量的糖蛋白,由两个分子量为250kd的链通过一对二硫键相连,以两种形式存在:(1)在胞外基质中以不溶性糖蛋白二聚体存在,并作为连接物;(2)在血浆中以可溶性二硫键连接的二聚体形式存在。我们探讨的是作为以胞外基质形式存在的纤维粘附素,它具有被整合素所特异性识别的结构域(RGD)。纤维粘附素通过整合素与细胞骨架相联系,从而影响粘附细胞的形态、活动、基因表达和生存。本研究表明,细胞A2780和SW626经不同浓度的紫杉醇作用后,MTT法检测FN组细胞生存率均明显高于NO2FN组,流式细胞仪检测提示细胞A2780和SW 626经一定浓度的紫杉醇作用后,FN组细胞凋亡率明显低于N02FN组,提示细胞与胞外基质纤维粘附素粘附后可抑制化疗药物紫杉醇诱导的细胞凋亡从而导致耐药。Survivin基因(生存蛋白或存活素)是新近发现的一种凋亡抑制基因,位于17q25,全长15kb,由4个外显子及3个内显子组成,主要表达于G2～M期[2],其主要功能是抑制细胞凋亡和促进细胞分裂。Survivin蛋白主要通过和细胞凋亡终末效应分子Caspase23、Caspase27前体结合抑制其活性从而抑制细胞凋亡[3]。此外,Survivin蛋白和纺锤体结合保持其稳定性从而促进细胞分裂[2]。Survivin基因表达于胚胎和发育的胎儿组织中,在成人终末分化组织(胸腺、生殖腺除外)无表达,而在各种肿瘤组织中有广泛表达[4]。纤维粘附素介导细胞粘附后产生信号并且激活细胞存活途径。Mara等[5]证实,在前列腺癌细胞株中,纤维粘附素和整合素结合后可上调Survivin的表达而免于TNF诱导的凋亡,而通过Survivin显性负性突变体可抑制纤维粘附素对细胞存活的保护作用。本实验通过Western Blot和FACS检测Survivin蛋白表达,结果表明,两株细胞的FN组Survivin蛋白表达明显高于N02FN组。据此推测,细胞与纤维粘附素结合后可能上调Survivin基因表达,其表达产物主要和细胞凋亡终末效应分子Caspase23、Caspase27前体结合抑制Caspase23和Caspase27的活性,从而抑制紫杉醇引起的细胞凋亡。此外,Sur2vivin表达产物在G2～M期和纺锤体结合,使纺锤体保持其稳定性免受微管毒性药物紫杉醇的损伤。据此,我们认为,Survivin基因可能为目前逆转纤维粘附素介导粘附耐药提供一个新的治疗靶点。但是,纤维粘附素介导细胞粘附并激活细胞存活有无其它基因参与有待进一步研究。参　考　文　献[1]　Dam iano JS,Cress AE,Hazlehurst LA,et a.lCell Adhe2sion drug resistance(CAM 2DR):role of integrins and re2sistance to apop tosis in human myeloma cell lmies[J].B lood,1999,93:165821667[2]　L i F,Ambrosini G,Chu EY,et a.lControl of apop tosis andm itotic sp indle checkpoint by surviving[J].Nature,1998,396:5802584[3]　Suzuki A,Ito T,Kawano H,et a.lSurvivin initiates p ro2caspase23/p21 comp lex formation as a result of interac2tion w ith cdk4 to resist Fas2mediated cell death[J].On2cogene,2000,19:134621353[4]　Ambrosini G,Adida C,A ltieri DC.A novel anti2apop tosisgene,surviving,exp ressed in cancer and lymphoma[J].Nat M ed,1997,3:9172921[5]　M ara F,Janet P,Sophie C,et a.lFibronectin p rotects p ros2tate cancer cells from tumor necrosis factor2α2induced ap2op tosis via the Akt/Survivin pathway[J].J B iol Chem,2003,278:50402250411