卵巢组织冷冻和移植研究进展

作者:魏丽娜,李治学,丁家桐  【关键词】  移植

     ［摘要］ 卵巢是女性重要的生殖和内分泌器官，卵巢组织冷冻和移植将取代激素替代疗法成为恢复女性患者生殖功能和内分泌功能的重要方法。随着卵巢组织冷冻和移植相关技术的深入研究，其在生殖领域应用前景广阔。

    ［关键词］ 卵巢；冷冻；移植；生殖

      Research progress of ovarian tissue cryopreserved and transplantation

    WEI Lina，LI Zhixue，DING Jiatong.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China

    ［Abstract］ Ovary is an important organ for the reproduction and endocrine of female.Ovarian tissue freezing and transplanting which will take the place of the hormone replacement therapy are important for restoring the functions of feminine reproduction and the endocrine.As the current reasearchs in correlative technology of ovarian tissue freezing and transplanting，it will have a better future.

    ［Key words］ ovary；cryopreserved；transplantation；reproduction

    卵巢移植的历史最早可追溯到18世纪，在1932年Aldous Huxley［1］就预言冷冻的卵巢组织移植在人类的试管生殖中的应用，该技术就是现在所说的体外受精和克隆（Huxley，1932）。1950年，Kim SS等［2］开始用冷冻保存的性腺组织进行移植，但由于移植效果不理想，使得这一技术被长期搁置。直到1990年，随着对性腺组织保存技术临床应用潜力认识的提高及动物科学知识的发展，才又重新激发了人们对于卵巢移植的兴趣。本文将着重讨论卵巢冷冻和移植技术的发展及其在生殖领域的应用。

    1 卵巢组织的冷冻保存

    1.1 卵巢组织冷冻保存的可行性 自20世纪60年代末，就已经开始进行动物卵巢的低温冻存研究。Parrot等（1960）［3］用甘油作保护剂在-79 ℃冷冻保存小鼠的卵巢获得成功。近年来，卵巢冷冻技术迅速发展，在羊、大鼠、小鼠、恒河猴等动物上已有冷冻卵巢组织移植后恢复生殖力的报道。在2004年［4］Donnez等报道了首例冷冻人卵巢组织移植后获得妊娠的病例。

    1.2 影响卵巢组织冷冻保存效果的因素

    1.2.1 冷冻损伤 从低温生物学角度来看，冷冻卵巢皮质组织富有挑战性，因为卵巢皮质中包含许多不同类型的细胞，比如基质细胞、卵泡、颗粒细胞和膜细胞。此外，血管和神经对于移植卵巢功能的恢复也很重要。因此，就需要一种渗透性好的冷冻保护剂，还应尽量避免其对细胞的毒性。

    1.2.2 冷冻保护剂的毒性作用 冷冻保护剂的毒性依其化学特性、与细胞接触时间和温度的不同而不同，目前常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇（PROH）、乙烯乙二醇（EG）及甘油。Newton等（1996）［5］研究发现，以DMSO、PROH、EG和甘油作为冷冻保护剂，将冷冻-解冻后的卵巢组织移植入免疫缺陷小鼠肾囊内是可行的，其中乙二醇作为冷冻保护剂移植物的存活率最高，甘油冷冻效果明显较其他保护剂差。Newton等（1998）［6］还研究了冷冻保护剂渗透组织的时间，以乙二醇的效果最好。目前，乙二醇已在临床上应用，解冻后的卵巢组织移植所获得的卵母细胞有受精能力［7］。但是，对于不同类型的细胞和组织，均应考虑所选择冷冻保护剂是否为低毒的、具有最佳渗透力的以及形成冰晶最少具组织特异性的［8］。在选择冷冻保护剂时，可以将几种混合使用，效果往往优于使用单一的冷冻保护剂。

    1.2.3 冷冻方法 传统的卵巢组织冷冻多采用Oktay等于1998年提出的慢速冷冻-快速解冻的方法，但该方法操作比较复杂，且慢速冷冻往往会导致冰晶的形成，造成渗透损伤。目前采用的慢速程序控制降温的冷冻方法，不仅费时、消耗液氮量多，而且需要专门的仪器，一般实验室不易实施。为了移植能够成功，选择最佳冷冻方法来获得质量最好的卵巢组织是很重要的，很多研究都关注于解冻后卵泡的分化，卵母细胞的形态、发育和受精情况。由于玻璃化冷冻技术具有操作简单、不易形成冰晶、低渗透损伤等优点，该技术已在小鼠、大鼠、中国仓鼠、兔、日本猿、牛及人的卵巢组织冷冻上获得成功。G Rahimi等（2004）［9］比较了传统慢速冷冻和玻璃化冷冻对人卵巢组织异种移植后坏死情况的影响，证明玻璃化冷冻是可以替代传统慢速冷冻的。Bordes A等（2005）［10］用玻璃化冷冻法冷冻山羊半个卵巢后原位移植，母羊正常妊娠并产下幼仔。

    近年来，有学者先后报道了整个卵巢冷冻获得成功。Migishima等（2003）［11］对小鼠的整个卵巢进行玻璃化冷冻，发现可以有效地保存卵巢的功能。Ariel Revel等（2004）［12］使用一种以定向冷冻技术（directional freezing technology）为原理的新型冷冻装置MultiThermalGradient冷冻山羊的整个卵巢，自体移植后卵泡发育。虽然人类卵巢比山羊大，但山羊卵巢和人类卵巢很相似，都有致密的纤维基层，皮质中都有大量的原始卵泡。因此，通过深入研究，选择适当的冷冻保护剂和冷冻方法，可以进行人类整个卵巢组织的冷冻。

    2 卵巢组织移植

    2.1 自体异位移植 大量的试验已证明了卵巢异位移植是可行的，移植后激素水平可以恢复正常并排卵。这在大鼠、小鼠、兔、山羊和人上均有成功报道，而对于异位移植的长期效果的研究很少。Lee等（2004）［13］首次将新鲜卵巢组织植入恒河猴身体不同部位，超声波诊断已恢复月经周期和卵泡发育后，取成熟卵母细胞通过单精显微注射（ICSI）受精，将桑椹胚移植到代孕母猴体内，最终成功生下了一只健康的小猴。该实验说明将卵巢移植和体外受精结合可以恢复生殖力，这也为人类生殖临床研究奠定了基础。

    2.2 异体移植 同种异体移植临床上主要适用于先天性卵巢发育异常、卵巢功能早衰等患者。异体移植主要需解决两方面问题：一是免疫排斥反应，二是供体卵巢的来源。随着免疫抑制药物的开发，免疫排斥反应得到了改善，Green等（1982）［14］首次使用环孢素A对50只家兔的卵巢和附件异体原位移植进行了研究，在停止环孢素A治疗18个月后，80％的受体在交配行为、排卵及输卵管卵子转运方面均正常。1例于移植后126天产下1只健康幼仔。但目前所用抗排斥药物都有毒性和副作用，治疗费用昂贵，使得同种异体移植的临床应用受到限制，在国外鲜有报道。

2.3 异种移植 由于异种移植能够引起强烈而迅速的超免疫排斥反应，因而主要限于动物模型研究。近年来，带有免疫缺陷基因的啮齿类动物成了人类卵巢皮质异种移植的理想材料。如裸鼠（nude mice）和SCID鼠（severe combined immunodeficient mice）。将卵巢组织异种移植入免疫缺陷小鼠可以作为模型来研究卵泡的发育、冷冻对卵泡存活率的影响，还可以作为一种保存癌症患者、珍稀动物和濒危物种生殖力的有效的方法。对于癌症患者来说，将卵巢组织移植给动物宿主使卵细胞成熟并排卵，既可以消除癌症的传播和复发，同时还可以解决卵母细胞体外生长和成熟的难题。

    异种移植使得以动物为载体来孕育人类卵子成为可能，但在临床上的应用有着局限性，由于此法涉及到社会伦理问题，不能被广泛接受；另一方面，以动物为载体孕育卵子能否导致人类基因发生改变，需要深入研究。

    3 卵巢移植关注问题及展望

    目前，卵巢移植已经开始在临床上应用，但还存在许多需要解决的问题：（1）目前的冷冻技术尚无可遵循的统一标准，无法确定哪一种最理想。（2）最佳的移植位点还不确定。（3）需要找到能够减少局部缺血损伤的方法，使得移植物尽快恢复血供。（4）移植后卵巢功能能够维持的时间以及如何设法使时间延长。（5）移植技术需要进一步的完善来减少移植带来的损伤。（6）卵巢组织的安全性，癌肿再种植的危险性。（7）如何解决卵巢异体、异种移植将面临的一些社会伦理问题、心理健康等问题。

    随着对卵巢移植相关技术的深入研究，流式细胞学、FISH等辅助检测技术的不断进步，卵巢移植在生殖医学领域应用前景广阔。

    ［参考文献］

    1 Huxley A.Brave New World.London:Granada，1932，1-16.

    2 Kim SS，Battaglia DE，Soules MR.The future of human ovarian cryopreservation and transplantatation:fertility and beyond.Ferility and Sterility，2001，75（6）:1049-1056.

    3 Parrot DM.The fertility of mice with orthotopic ovarian grafts derived from frozen tissue.Reproduction，Fertility，and Development，1960，1:230-241.

    4 Donnez PJ，Dolmans M，Demylle D.Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue.Lancet，2004，364（9443）:1405-1410.

    5 Newton H，Aubard Y，Rutherford A.Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.Human Reproduction，1996，11:1487-1490.

    6 Newton H，Fisher J，Amold JR.Permeation of human ovarian tissue with cryoprotective agents in preparation of cryopreservation.Human Reproduction，1998，13:376-378.

    7 Schmidt KL，Yding Andersen C，Starup J.Orthotopic autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue to a woman cured of cancerfollicular growth，steroid production and oocyte retrieval.Reproductive BioMedicin Online，2004，8:448-453.

    8 Fuller B，Paynter S.Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine.Reproductive BioMedicine Online，2004，9:680-691.

    9 G Rahimi，E Isachenko，V Isachenko，et al.Comparison of necrosis in human ovarian tissue after conventional slow freezing or vitrification and transplantation in ovariectomized SCID mice.Reproductive BioMedicien Online，2004，9（2）:187-193.

    10 Bordes A，Lornage J，Demirci B，et al.Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrifiedwarmed hemiovaries into ewes.Human reproduction，2005，20 （10）:2745-2748.

    11 Migishima F，Suzuki MT，Song SY.Successful cryopreservation of mouse ovaries by vitrification.Biology Reproduction，2003，68（3）:881-887.

    12 Ariel Revel MD，Amir Elami MD，Ameir Bor DVM，et al.Whole sheep ovary cryopreservation and transplantation.Fertility and Sterility，2004，82（6）:1714-1715.

    13 Lee DM，Yeoman RR，Battaglia DE.Live birth after ovarian tissue transplant.Nature，2004，428（6979）:137-138.

    14 Green CJ，Simpkin S，Grimaldi G.Pregnancy after autografting and allografting ovaries and en bloc vascularized ovaries with adnexa in rabbits.Br J Obstet Gynecol，1982，89（8）:645-651.

     作者单位： 225009 江苏扬州，扬州大学动物科学与技术学院