乳腺癌患者外周血EMA、EGP2和CK19的检测及其临床意义

作者:孙善平,臧益秀,王晓

作者单位：山东大学附属济南市中心医院乳腺外科， 济南 250013

   【摘要】  目的 检测乳腺癌患者外周血上皮膜抗原（EMA）、表皮糖蛋白基因（EGP2）和细胞角蛋白19（CK19）的表达，探讨EMA、EGP2和CK19作为乳腺癌微转移指标的应用价值。 方法 应用流式细胞术检测65例乳腺癌患者和37例乳腺良性疾病患者外周血EMA 、EGP2和 CK19的表达情况，分析其与TNM分期、年龄、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移以及ER和PR表达状态等临床病理学指标的关系。结果 乳腺癌患者外周血EMA、EGP2和CK19的阳性表达率均高于对照组（P＜0.05）；其阳性细胞表达率与TNM分期、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移情况明显相关(P＜0.05)。3指标联合检测相对于2项或单项检测敏感度及准确性升高(P＜0.05)。 结论 联合检测EMA、EGP2和CK19可提高诊断正确率，有可能在乳腺癌预后预测和治疗中发挥作用。

【关键词】  乳腺肿瘤；流式细胞术；CA153抗原；基因；角蛋白

基金项目：济南市卫生局科技计划立项项目（200516）。

　　SUN Shanping， ZANG Yixiu, WANG Xiao, CHEN Liansheng, TIAN Bin, SUN Tao, JIN Guangchao

　　Department of Breast Surgery， Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013， China

　　To explore the expressions of EMA, EGP2 and CK19 in peripheral cells of breast cancer and their diagnostic value as micrometastasis targets for breast cancer. Methods  EMA, EGP2 and CK19 were determined by flow cytometry in 65 cases of breast cancer and 37 cases of benign breast diseases， also the TNM stages, age, size of tumors, maxillary lymph nodes metastasis and expressions of estrogen receptors and progestin receptors were analyzed. Results  The expression rates of EMA, EGP2 and CK19 in peripheral cells were higher than those in the normal controls(P＜0.05) and closely related to the TNM stages，size of tumor and maxillary lymph node metastasis(P＜0.05). The sensitivity and accuracy of the EMA，EGP2 and CK19 combination were higher than those of one or two (P＜0.05). Conclusions  Combination detection of EMA, EGP2 and CK19 improves the diagnostic sensitivity and accuracy, and may play an important role in the prognosis and treatment of breast cancer.

　　Key words： Breast neoplasms; Flow cytometry; CA153 antigen; Genes; Keratin  

　　乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，近年来，乳腺癌的发病率在明显增加，探讨与其复发和转移相关的生物学指标是当前研究的重要课题［1］。乳腺癌肿瘤标志物种类繁多，但单一指标的检测因敏感度、特异性等原因较难达到目的。为了提高诊断的敏感性和准确性，我们应用流式细胞技术联合检测了乳腺癌患者外周血上皮膜抗原（epithelial membrane antigen,EMA）、表皮糖蛋白基因（epithelial glycoprotein gene2,EGP2）和细胞角蛋白19（cytokeratin 19,CK19）的表达情况，探讨其在乳腺癌微转移预测和诊断中的价值。

　　1  资料与方法

　　1.1  资料

　　1.1.1  临床资料

　　65例乳腺癌患者系山东大学附属济南市中心医院2006年7月至2007年7月住院患者，所有病例均按照美国癌症联合委员会(AJCC)乳腺癌TNM分期进行分类，其中0期9例，Ⅰ期16例，Ⅱ期19例，Ⅲ期13例，Ⅳ期8例。组织学类型：浸润性导管癌52例，导管内乳头状癌9例，鳞状细胞癌2例，髓样癌1例，粘液癌1例。腋窝淋巴结转移36例，无转移29例。年龄31～76岁，中位年龄45岁。37例乳腺良性疾病患者，其中乳腺增生症14例，乳腺纤维腺瘤14例，导管内乳头状瘤5例，浆细胞性乳腺炎4例。102例乳腺疾病患者均为病理证实的初诊者，排除患其他肿瘤的可能性。所有患者均了解本研究目的，并签署知情同意书。手术前采集静脉血。采血前均未接受化学治疗和放射治疗。

1.1.2  试剂与仪器

　　EMA兔抗人单克隆抗体、EGP2鼠抗人单克隆抗体和CK19鼠抗人单克隆抗体均购自晶美生物工程有限公司；预冷固定液、破膜剂由北京市晶美基因谷科技有限公司提供；淋巴细胞分离液系上海试剂二厂产品；FACS Calibur流式细胞仪，氩离子激光器功率为15?Mw,激发光波长为488?nm，购自美国BECTON DICKINSON公司； BFX5320低速自动平衡离心机系白洋离心机厂产。

　　1.2  方法

　　1.2.1  外周血分离单核细胞

　　清晨空腹时用负压针筒采血，留取第2管血标本。抽取6.0?mL静脉血经0.5?mL/L EDTA抗凝后均分为3份置于冰箱内4?℃保存，24?h之内处理。3份血液分别进行EMA、EGP2和CK19检测。以EMA为例，将抗凝血标本用2?mL PBS液稀释后加入到4?mL淋巴细胞分离液中，2?000?r/min, 离心20?min,将单个核细胞层吸出。

　　1.2.2  流式细胞术  　　将吸出的单个核细胞层放入试管中，1?000?r/min，离心5?min后弃去上清液，加入PBS液2?mL，低速混匀，1?000?r/min，离心5?min后弃去上清液，重复用PBS液清洗1遍，收获待测细胞。先加入500?μL预冷(4?℃)固定液，室温下孵育10?min, 1?000?r/min, 离心10?min后弃去上清液，加入PBS液清洗1次， 1?000?r/min，离心5?min后弃去上清液,再加入1.5?mL破膜剂，混匀，室温下孵育15?min， 1?000?r/min, 离心5?min后加入2?mL PBS液，低速混匀，均分成2管，其中1管为试验管，另1管为阴性对照管。实验管加入EMA兔抗人单克隆抗体5?μL,低速混匀，室温孵育30?min，加PBS液2?mL, 1?000?r/min, 离心5?min后弃去上清液。试验管和对照管分别加入荧光二抗5?μL,低速混匀，室温下避光20?min，加入PBS液2?mL, 1?000?r/min, 离心5?min后弃去上清液，加1%多聚甲醛0.5?mL,低速混匀，放置于冰箱中4?℃下避光保存以备上机检测。

　　1.2.3  应用Cell quest软件程序获取20?000个细胞样品，用每105个细胞中检测到的肿瘤标志物细胞数来表示外周血的肿瘤细胞含量,未检测到肿瘤细胞为阴性,反之则为阳性。

　　1.2.4  相同实验方法和实验条件下同时进行EGP2 和CK19的检测。

　　1.3  统计学处理

　　均数资料的比较采用t检验，组间率的比较采用χ2检验，检验水准а=0.05，所有统计均由SPSS10.0软件完成。

　　2  结  果

　　2.1  血清肿瘤标志物阳性例数的表达率

　　见表1（略）。 EMA 、EGP2和 CK19在乳腺癌患者中的阳性表达率均高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

　　2.2  血清肿瘤标志物与临床病理学指标的关系

　　见表2（略）。乳腺癌患者外周血EMA、EGP2和 CK19阳性细胞的表达与TNM分期、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移情况明显相关（P＜0.05），而与患者年龄、绝经状态、雌激素受体(estrogen receptor, ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)的表达状态无明显相关性（P＞0.05）。

　　2.3  EMA、EGP2和CK19联合检测对乳腺癌的诊断价值

　　见表3（略）。单项检测敏感度为24.62%～36.92%，2项和3项联合检测对乳腺癌诊断的敏感度及准确性明显升高，其中2项检测敏感度为44.62%～50.77%，准确性为59.80%～62.75%。而3项联检敏感度及准确性分别可达73.85%和74.51%，差异具有统计学意义（P＜0.05），特异性改变无统计学意义。

　　3  讨  论

    乳腺癌微转移是指在乳腺癌发展过程中，播散于血液循环、淋巴系统、骨髓以及肝、肺等各组织器官中的肿瘤细胞，但尚未形成转移结节，常无任何临床表现，常规检测方法难以发现微小病灶。虽然并不是所有播散的肿瘤细胞都能引起临床转移，但肿瘤细胞的播散是临床转移的重要前提，故早期检测外周血肿瘤细胞对乳腺癌的诊断及综合治疗具有重要的意义。肿瘤标志物是肿瘤组织产生并可以反映肿瘤细胞存在于宿主体内的化学分子。其选择原则是应在特定的肿瘤中表达而在淋巴结、骨髓和血清中则不表达，但满足此原则的敏感度和特异性都高的标志物却很少，一种标志物可在多种肿瘤中表达，一种肿瘤也可表达多种标志物。为提高检出的敏感度和准确性，常需联合几种不同的标志物进行检测以提高对肿瘤的诊断价值［2］。乳腺癌绝大多数发源于上皮组织，所以上皮组织的某些特异性标志物可用于肿瘤转移的标记。本研究特别注重采集第2管血标本,采血所用负压针筒等用品均为一次性使用,以尽量避免采集标本时针头接触皮肤而造成假阳性，从而最大限度保证实验的可靠性。

 EMA是从人乳脂小球膜上分离的糖蛋白的总称，广泛存在于人体各种上皮细胞中，其分布与细胞角蛋白极为相似，但对内脏腺上皮表达优于细胞角蛋白，因此，EMA可作为上皮源性肿瘤的标志物。EMA在癌组织中存在畸形糖基化和不完全糖基化，使其核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，尤其在分化差的癌组织呈强表达,是上皮来源恶性肿瘤的特异抗原之一［36］，可用于判断乳腺癌患者有无转移［7］。EMA的表达与肿瘤特征及临床预后密切相关并可作为独立的危险预测因子用于评估无瘤生存期（relapse free survival，RFS）和完全生存期（overall survival，OS）［8］。

    EGP2是上皮细胞的又一标志基因，其在上皮细胞正常表达，并编码38kD的跨膜糖蛋白。几乎所有上皮来源的肿瘤均表达EGP2，而非上皮来源的肿瘤则无表达。97%乳腺癌癌组织中可检测到EGP2，其在原发和转移癌组织中表达率较外周血中高10倍［9］，较正常组织高100～1?000倍［10］。DeGraaf等研究显示4种乳腺癌细胞系均有EGP2基因的高表达［11］，其表达下调可以降低肿瘤细胞的致癌潜能［12］，临床检测其表达水平可用于肿瘤免疫治疗［13］。

    细胞角蛋白是一类细胞结构蛋白的总称，根据其相对分子质量、等电点等不同可分为1～20个片段，为上皮来源的细胞特异性表达，但在健康人外周血中无表达［14］。其中CK19具有高度组织特异性，其在乳腺癌中广泛表达，是检测乳腺癌微转移最有价值的标志物之一［1516］。原发性乳腺癌患者外周血中检测到CK19，可提示血道发生微转移的可能。

    本研究显示，乳腺癌患者外周血中EMA、 EGP2和CK19阳性表达率均明显高于乳腺良性疾病患者，表明3种标志物对于检测乳腺癌外周血循环肿瘤细胞具有较高的特异性。同时我们发现，在乳腺良性疾病患者外周血中，也有EMA（3例）、EGP2（3例）及CK19（3例）的阳性表达，可能为上皮细胞污染或者肿瘤标志物与未成熟的造血细胞起反应等原因所致的假阳性，也可能与流式细胞术检测方法在提高敏感性的同时其特异性降低有关。统计分析表明，乳腺癌组与良性疾病组相比较，外周血检测结果差异有统计学意义(P＜0.05)。本研究中，各指标对乳腺癌微转移诊断的敏感度均较低，在24.62%～36.92%之间，而联合检测时敏感度则明显提高，EMA+EGP2敏感度为46.16%，EMA+ CK19为50.77%，EGP2 +CK19为44.62%， EMA+EGP2+CK19则可达73.85%，表明两项指标联合检测虽然能够提高乳腺癌微转移诊断的敏感度，但3项同时检测的组合方式可获得更高的敏感度和准确性，而特异性改变无统计学意义，提示联合检测EMA、EGP2 和CK19可提高对乳腺癌微转移的诊断正确率。此外，EMA、EGP2和CK19阳性细胞数的表达与TNM分期、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移密切相关，提示外周血肿瘤标志物水平可能随乳腺肿瘤的进展而升高［17］。三者表达与患者年龄、绝经状态、ER和PR表达状态等相关性不密切。    综上所述，联合检测EMA、EGP2和 CK19对发现乳腺癌外周血微转移具有重要意义，并有望成为预测预后和指导治疗的有效方法。

【参考文献】  　　［1］李树玲.乳腺肿瘤学［M］.北京:科学技术出版社，2000:287292.

　　［2］万文徽.肿瘤标志临床应用中的若干问题［J］.中华检验医学杂志，2000,23（1）：910.

　　［3］Yang E,Hu X F. Advances of MUC1 as a target for breast cancer immunotherapy［J］. Histol Histopathol, 2007, 22(8):905922.

　　［4］CarrBrendel V, Markovic D, Ferrer K, et al. Immunity to murine breast cancer cells modified to express MUC1, a human breast cancer antigen, in transgenic mice tolerant to human MUC1［J］. Cancer Res, 2000, 60(9):24352443.

［5］Soares M M, Mehta V, Finn O J. Three different vaccines based on the 140amino acid MUC1 peptide with seven tandemLy repeated tumor specific epitopes elicit distinct immune effector mechanisms in wild type versus MUC1 transgenic mice with different potential for tumor rejection［J］. J Immunol, 2001, 166(11):65556563.

　　［6］Musselli C, Ragupathi G, Gilewski T, et al. Reevaluation of the cellular immune response in breast cancer patients vaccinated with MUC1［J］. Int J Cancer, 2002, 97(5):660667.

　　［7］崔大祥，王岭，闫晓军,等. nm23 H1与muc1基因在乳腺癌中的表达及其临床意义［J］. 第四军医大学学报, 1999,20(9)：823826.

　　［8］van der Vegt B,Roos M A.The expression pattern of MUC1(EMA) is related to tumor characteristics and clinical outcome of invasive ductal breast carcinoma［J］. Histopathol, 2007, 5151(2):227238.

　　［9］Rao C G, Chianese D, Doyle G V, et al. Expression of epithelial cell adhesion molecule in carcinoma cells present in blood and primary and metastatic tumors［J］. Int J Oncol, 2005, 27(1):4957.

　　［10］Osta W A, Chen Y. EpCAM is overexpressed in breast cancer and is a potential target for breast cancer gene therapy［J］. Cancer Res, 2004, 64(16):58185824.

　　［11］de Graaf H, Melandsmo G M, Ruud P, et al. Ectopic expression of target genes may represent an inherent limitation of reverse transcriptasepolymerase chain reaction assays used for micrometastases detecton: Studies on the epithelial glycoprotein gene EGP2［J］. Int J Cancer, 1997, 72(1):191196.

　　［12］Gommans W M, McLaughlin P M. Engineering zinc finger protein transcription factors to downregulate the epithelial glycoprotein2 promoter as a novel anticancer treatment［J］. Mol Carcinog, 2007, 46(5):391401.

　　［13］McLaughlin P M,Harmsen M C.The epithelial glycoprotein 2 (EGP2) promoterdriven epithelialspecific expression of EGP2 in transgenic mice: a new model to study carcinomadirected immunotherapy ［J］. Cancer Res, 2001, 61(10):41054111.

　　［14］邱林，丛笑，张远春，等.肿瘤细胞株和癌组织角蛋白19、20mRNA表达及临床意义［J］.中华肿瘤杂志，2000,22（1）：3235.

　　［15］Schoenfeld A, Kruger K,Gomm J, et al. The detection of micrometastases in the peripeheral blood and bone marrow of patients with breast cancer using immunohistochemistry and reverse transcriptase polymerase chain reaction for keratin 19［J］. Eur J Cancer, 1997, 33(6):854861.

　　［16］Zhang J, Shen K W, Liu G, et al. Antigenic profiles of disseminated breast tumour cells and microenvironment in bone marrow［J］. Eur J Surg Oncol, 2003, 29(2):121126.

　　［17］Rahn J J， Dabbagh L， Pasdar M， et al. The importance of MUC1cellular localization in patients with breast carcinoma: an immunohistologic study of 71 patients and review of the literature［J］. Cancer, 2001, 91(11):1973.