阿司匹林对宫颈癌Hela细胞COX-2 mRNA表达的抑制作用
发表时间：2009-06-23 浏览次数：556次
作者:郑秀娟,李淞漪
作者单位：321000 浙江省金华市中心医院妇产科
【摘要】 目的 研究COX-2非选择性抑制剂阿司匹林（Aspirin）对宫颈癌细胞株Hela的细胞增殖的抑制作用及COX-2 mRNA表达量的影响。方法 Hela细胞分4组培养在6孔板上设对照组及实验组,观察不同剂量阿司匹林作用后细胞的增殖状态及采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测阿司匹林作用前后Hela细胞COX-2mRNA量的变化。 结果 阿司匹林能抑制Hela细胞增殖及细胞中COX-2 mRNA的转录，且抑制强度随阿司匹林的浓度的提高而增加。 结论 体外阿司匹林抑制癌细胞Hela生长，并从mRNA水平抑制COX-2蛋白的表达，对宫颈癌可能有潜在治疗意义。
【关键词】 阿司匹林 环氧合酶-2 宫颈癌 Hela
【Abstract】 Objective To investigate the effect of the non-selective inhibitor aspirin on the proliferation of cervical cancer cells and on the transcription of COX-2 mRNA in vitro. Methods Hela cells were treated with aspirin. the proliferation of the cells was observed by discrepancy microscope.The quantity of COX-2 mRNA were measured by using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results Aspirin can inhibit proliferation of Hela cells and COX-2 mRNA transcription and the effect was in concentration dependent with aspirin. Conclusion Aspirin can inhibit the cells proliferation in vitro and inhibit COX-2 protein expression in the transcription level, which is of potential therapeutic value in treating cervical cancer.
【key words】 Aspirin Cox-2 cervical cancer Hela 阿司匹林（Aspirin）是环氧化酶-2(COX-2)的非特异性抑制剂，COX-2是分解花生四烯酸，生成各种内源性前列腺素(ＰＧE2)过程中重要的限速酶,参与多种肿瘤的发生和发展。研究表明，COX-2抑制剂能加强恶性肿瘤的放疗疗效，但目前尚无阿司匹林可用于宫颈癌的临床实验证据。本研究通过用阿司匹林作用体外培养宫颈癌细胞(Hela)，观察细胞增殖情况并对阿司匹林作用 Hela细胞的机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1 材料 细胞系与试剂：人宫颈癌细胞系购自中国科学院上海生命科学院，Trizol 及RT试剂盒购于晶美公司，MEM培养基购自Invitrogen公司。COX-2引物序列：sense-TCA AGT CCC TGA GCA TCT ACG anti-sense-ACA TTC CTA CCA CCA GCA ACC 产物片段489bp ；内对照引物GAPDH引物序列：sense-CTT CTG GCT TAG CTC CATC anti-sense-ATC TCC CAG GGT TGC TTC产物为226bP的DNA片段。主要设备仪器：超净工作台(北京中化生物技术研究所)；CO2恒温培养箱(CELLSTAR)；像差倒置显微镜(OLYMPUS)。
1.2 方法 (1)细胞培养：细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基，置于37.0℃、5%CO2的混合气体培养箱中，每培养2d换液，3～5d用0.25%胰酶消化传代。(2)Hela细胞mRNA的提取：Hela细胞按每孔2×105接种在孔径为3cm的6孔板内，培养至细胞贴壁，分3组：对照组（常规MEM培养基），A1组（阿司匹林100μmol/L的MEM培养基） ，A2组（阿司匹林1mmol/L的MEM培养基），每组设3个复孔，48h后观察细胞生长状态及提取细胞用于实验。(3)Trizol提取总RNA：按Trizil产品说明书提取总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA，当比值达到260/280比为1.6～1.9时，可用于RT-PCR实验。(4)RT-PCR 测定COX-2 mRNA：RT-PCR采用两步法扩增，扩增条件为变性94℃、延伸72℃、退火57℃，共30个循环，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察结果，用凝胶影像软件分析DNA条带中COX-2与内对照产物GAPDH的比值。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件，数据以(x±s)表示，显著性检验采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 细胞形态学改变 阿司匹林作用的细胞15h起与对照组相比细胞生长状态有改变，细胞透光差，部分细胞漂浮死亡，且随着药物浓度的增加，细胞生长受抑情况加重。至48h A2组细胞数较A1组及对照组明显减少(图1、2)。 2.2 COX-2mRNA表达量的改变 三组细胞，提取总RNA逆转录及PCR扩增特异反应产物后，经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统显示扩增反应条带状(图3)。用软件分析COX-2条带和GAPDH条带光密度之比，对照组为=15.76±1.03，A1组为9.37±1.2，A2组为6.51±0.86，A1及A2组的相对光密度较对照组减少， A2组尤显著，可见随着阿司匹林浓度增加，COX-2 mRNA条带相对光密度呈减少的趋势，对照组与A1、A2组比较及A1与A2组比较，差异均有显著性(F=62.293,对照组与A1组比较P=0.000，对照组与A2比较p=0.000，A1组与A2组比较P=0.015）。
3 讨论 环氧合酶包括两个亚型COX-1 和COX-2，是前列腺素(PG)合成的限速酶,催化合成的PG参与多种病理过程。研究发现,COX参与多种肿瘤的形成和发展［１］,尤其是COX-2,从影响细胞凋亡、参与促进血管形成和肿瘤浸润等方面促进肿瘤发展。通常,COX-2在癌细胞中有高表达,但也有几种肿瘤中低表达,如胰腺癌和乳腺癌［２］。所以，在临床试验中要考虑肿瘤类型的差异。 阿司匹林是COX的非选择性抑制剂,属非甾体抗炎药(NSAIDs)，具有预防和抑制上皮性恶性肿瘤的作用。Rao等［３］发现NSAIDs可通过抑制COX 和NOS-2激活来抑制结肠癌的发展。最新研究表明阿司匹林结合放射治疗可诱导癌细胞凋亡,并明显提高宫颈癌Hela TG细胞的化疗敏感性，化疗前应用1 mM阿司匹林可增加凋亡细胞比率及提高放疗效应［４］。但NSAIDs在癌细胞中的效应除了被COX-2所调节，也和COX-2的下游效应分子相互作用。肿瘤细胞具有释放免疫抑制因子产生免疫耐受及免疫逃逸现象的功能，Lang等［５］研究发现，肿瘤细胞通过抑制免疫细胞的生理功能产生免疫抑制，阿司匹林能恢复免疫细胞的生理功能，从而达到抗肿瘤作用。本实验通过观察阿司匹林作用后Hela细胞生长状态的改变及COX-2 mRNA表达量的差异，探讨阿司匹林的抗宫颈癌细胞的作用及可能机制，推测阿司匹林可能通过在转录水平抑制COX-2蛋白的表达来抑制宫颈癌细胞，可能有潜在的宫颈癌辅助治疗意义。
【参考文献】 1 Xie YH,Yuan MB. A relationship between cyclooxygenase-2 expression and tumor angiogenesis in experimental rat liver carcinogenesis. Zhonghua GanZang Bing Za Zhi，2006，14(9):676～679.
2 Abbadessa G,Spaccamiglio A,Sartori ML，et al. The aspirin metabolite, salicylate, inhibits 7,12 -dimethylbenz ［a］ anthracene-DNA adduct formation in breast cancer cells. Int J Oncol，2006，28(5):1131～1140.
3 Rao CV,Reddy BS,Steele VE，et al. Nitric oxide-releasing aspirin and indomethacin are potent inhibitors against colon cancer in azoxymethane-treated rats: effects on molecular targets. Mol Cancer Ther，2006，5(6):1530～1538.
4 Kim KY,Seol JY, Jeon GA，et al. The combined treatment of aspirin and radiation induces apoptosis by the regulation of bcl-2 and caspase-3 in human cervical cancer cell.Cancer Lett Jan，2003，189(2):157～166.
5 Lang S,Picu A,Hofmann T，et al. COX-inhibitors relieve the immunosuppressive effect of tumor cells and improve functions of immune effectors. Int J Immunopathol Pharmacol， 2006，19(2):409～419.
