卵巢癌组织及细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因表达的研究

作者:张师前 作者单位：山东大学齐鲁医院妇科， 山东 济南 250012

     【摘要】  目的：观察卵巢上皮性癌组织及细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE 基因的表达，以探讨基因表达与诊断、治疗及预后的关系，评价基因产物作为卵巢癌标志物以及卵巢癌免疫治疗靶位的可行性。方法：采用 RTPCR分析10例正常卵巢、20例卵巢良性肿瘤、47例卵巢上皮性癌组织及3种卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1中MAGE1、MAGE3、GAGE1/2及BAGE基因mRNA水平的表达。结果：正常卵巢组织中MAGE、GAGE、BAGE基因无表达，良性肿瘤中仅有MAGE1基因表达，阳性率为15％（3/20）。卵巢癌组织MAGE1、MAGE3的表达率较高，分别为51.1％（25/47）、34％（16/47），GAGE1/2及BAGE基因在卵巢癌组织中的表达率分别为25.5％（12/47）和14.9％（7/47）。卵巢癌转移灶仅有MAGE1、BAGE基因表达，阳性表达率分别为28.6％（2/7）、14.3％（1/7）。浆液性囊腺癌MAGE1、MAGE3基因阳性表达率明显高于其它类型卵巢恶性肿瘤(P＜0.05)。结论：肿瘤特异性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因在卵巢癌中有较高表达，其表达与有无淋巴结转移无关，MAGE1、MAGE3基因的阳性表达与肿瘤分化程度及临床分期密切相关，伴有腹水的卵巢癌患者BAGE表达的阳性率较高。卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1的表达谱不尽相同，但至少有一种基因表达，其可作为卵巢癌免疫治疗的特异性靶点。

【关键词】  卵巢肿瘤 肿瘤特异性抗原 基因 MAGE 基因 BAGE 基因 GAGE

      ZHANG Shiqian1,　ZHOU Xiaoliang2,　ZHANG Linlin1,　WU Ximei3,　SHI Yan4

    （1. Department of Gynecology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China;

    2. Department of Gynecology, First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang

    471003, Henan, China;   3. Shandong Provincial Institute of Family Planning Research, Jinan 250002,

    Shandong, China; 4. Department of Gynecology, Qingzhou People′s Hospital, Qingzhou 262500, Shandong, China）

    ［ABSTRACT］  Objective: To explore the expression of MAGE, BAGE and GAGE genes in ovarian cancer tissues and cell lines. Methods: Expression levels of MAGE1, MAGE3, GAGE1/2 and BAGE were  determined by  reverse transcription polymerase chain reaction(PTPCR) in ovarian cancer cell lines SKOV3, A2780, COC1, and 10 cases of normal  ovarian tissues, 20 cases of benign epithelial tumor, and 47 cases of malignant epithelial tumor. Results: Normal ovarian tissues did not express members of the above gene families. In benign tumor tissue specimens, only 3 cases  expressed MAGE1 (3/20). 16(34%)， 12(25.5％), 7(14.9％) cases  of 47 ovarian cancer tissues. Conclusion: High expression of MAGE, BAGE and GAGE genes is produced in ovarian cancer tissues, which is related to the tumor grade, clinical stage, ascites, and the histological subtype, but is not related to age and lymph node metastasis.  There was at least one of these genes  expressed in ovarian cancer cell line SKOV3, A2780, and COC1.These tumorspecific antigens can be used as molecular markers for diagnosis and possible targets for immunotherapy.

［KEY WORDS］  Ovarian neoplasms; Tumor specific antigen; MAGE gene; BAGE gene; GAGE gene    自Van der Bruggen等［1］成功分离出人黑色素瘤抗原MAGE后，人们对其研究不断深入，随后发现了包括MAGE、GAGE、BAGE在内的肿瘤特异性基因家族，该组基因可表达于多种恶性肿瘤组织中，其中以黑色素瘤中的表达率最高，在正常组织中除胎盘和睾丸外均不表达，故又称肿瘤/睾丸抗原（CT抗原）。MAGE、GAGE、BAGE表达和肿瘤的发生、发展及预后关系密切。该类基因表达产生的抗原可以被自身免疫细胞所识别，并诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫，MAGE、GAGE、BAGE及其产物有望用于肿瘤的分子学诊断和免疫治疗。国内外学者对 MAGE、BAGE、GAGE基因的表达、功能及其机制做了大量的研究，但在卵巢癌方面的研究较少。本研究采用 RTPCR技术，同时分析卵巢癌组织及细胞株中MAGE1、MAGE3、GAGE1/2及BAGE基因mRNA的表达，以期评价这些基因产物作为卵巢癌标志物以及卵巢癌免疫治疗靶位的可行性。

    1  资料与方法

    1.1  细胞培养  SKOV3和COC1、A2780、正常卵巢上皮细胞(normal ovarian epithelial cells，NOEC) 由山东大学齐鲁医院生物工程中心提供。作为阳性对照的黑色素瘤MEL526细胞系由Dr.Takesako惠赠。细胞培养液含10％ 胎牛血清、100?U／ml青霉素和100?U／ml链霉素的RPMI1640；在37?℃、5％CO2和一定湿度的条件下孵育培养，当细胞生长到80％时，常规消化收集，置-80?℃冰箱保存待检。

    1.2  临床资料及组织标本  病例来自山东大学齐鲁医院妇科2004年12月至2006年3月手术治疗的患者，其中正常卵巢组织14例，卵巢良性肿瘤标本20例，卵巢癌标本47例、卵巢癌转移灶7例。所取组织于手术切除后10?min内液氮保存。并经病理组织学检查证实。卵巢癌患者年龄23 67?岁，平均45.7?岁。47例卵巢癌中浆液性囊腺癌18例，粘液性囊腺癌13例，子宫内膜样癌6例，透明细胞瘤4例，卵巢转移性瘤6例。组织学分级G1 6例、G2 24例、G3 17例。卵巢癌临床分期按FIGO（2000）分期标准:Ⅰ期4例、Ⅱ期9例、Ⅲ期30例、Ⅳ期4例。有腹水者24例，不合并腹水者23例。淋巴结转移21例，无淋巴结转移26例。

    1.3  MAGE1、MAGE3、GAGE1/2及BAGE基因mRNA表达测定  Trizol(上海生物工程有限公司产品)抽提各细胞株和组织标本总RNA。紫外分光度计测得RNA A260和A280。取4?μg RNA用逆转录酶MMLV和oligodT引物(上海生物工程有限公司产品)合成第一链cDAN。PCR引物设计在不同的外显子上，以保证扩增的特异性，避免基因组DNA污染的影响。引物序列见表1。

    引物序列P15′ACT ACC TTC ACT CG3′P25′CTC CCA TCA TAC ACC TCC3′MAGE3P15′TGG AGG ACC AGA GGC CCC C3′P25′GGA CGA TTA TCA GGA GGC CTG C3′GAGE1/2P15′GAC CAA GAC GCT ACG TAG3′P25′CCA TCA GGA CCA TCT TCA3′BAGEP15′TGG CTC GTC TCA CTC TGG3′P25′CCT CCT ATT GCT CCT GTT G3′βactinP15′AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT3′P25′GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT3′

    PCR扩增程序：MAGE1、βactin：94?℃变性45?s，55?℃退火45?s，72?℃延伸1?min,共35个循环；MAGE3：94?℃变性1?min，66?℃退火1?min 15?s，72?℃延伸1?min,共40个循环；GAGE1,2：94?℃变性1?min，56?℃退火2?min，72?℃延伸3?min,共30个循环；BAGE：94?℃变性1?min，60?℃退火2?min，72?℃延伸2?min,共30个循环；所有PCR扩增均需预变性5?min，反应末于72?℃延伸6?min。扩增结束后进行1.5％（质量分数）琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色后，紫外灯观察。捷达 801专业凝胶图像采集与分析系统（3.3 版）采集分析图片。以黑色素瘤MEL526 细胞系为阳性对照，以不加MMLV逆转录酶为阴性对照，以βactin为体系内控制。根据各肿瘤特异性抗原基因在GenBank中的序列，MAGE1、MAGE3、GAGE1/2及BAGE基因理想的PCR扩增长度分别为485、724、243、284?bp。

1.4  统计学处理  所有数据资料应用SPSS10.0统计软件进行处理。计量资料采用t检验，绝经、肿瘤组织学分型、临床分期等临床病理特征之间基因表达差异的比较采用χ2检验。P＜0.05差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  卵巢癌细胞株中MAGE、GAGE、BAGE基因的表达  MAGE、GAGE、BAGE在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1 中的表达谱不尽相同，但至少有一种基因表达。卵巢癌细胞株SKOV3表达的肿瘤特异性抗原基因有MAGE1,2号显带为MAGE1基因引物扩增结果，DNA条带介于400 500?bp之间(见图1A)。卵巢癌细胞株A2780表达的肿瘤特异性抗原基因有 MAGE1、MAGE3及GAGE1/2,2号为MAGE1基因引物扩增结果，DNA条带介于400 500?bp之间，3号为MAGE3基因引物扩增结果，DNA条带介于700 800?bp之间，5号为GAGE1/2基因引物扩增结果，DNA条带介于200 300?bp之间(见图1B)。卵巢癌细胞株COC1表达的肿瘤特异性抗原基因有MAGE1、MAGE3, 2号为MAGE1基因引物扩增结果，DNA条带介于400 500?bp之间，3号为MAGE3基因引物扩增结果，DNA条带介于700 800?bp之间(见图1C)。图1  SKOV3,A2780,COC1卵巢癌细胞株肿瘤特异性抗原基因MAGE、BAGE、GAGEmRNA表达谱

    2.2  MAGE、GAGE、BAGE基因在不同卵巢组织中的表达  正常卵巢组织中MAGE、GAGE、BAGE基因无表达，良性肿瘤中仅有基因MAGE1表达。卵巢癌组织中MAGE1、MAGE3的表达率较高，而GAGE1/2及BAGE基因在卵巢癌组织标本中的表达率相对较低。卵巢癌转移灶标本中仅有MAGE1、BAGE基因表达(表2，图2)。

    2.3  卵巢癌病理类型与MAGE、GAGE、BAGE基因阳性表达的关系  浆液性囊腺癌中MAGE1、MAGE3的阳性表达率明显高于其它类型卵巢恶性肿瘤中的表达率，差异有显著性(P＜0.05)。尽管GAGE1/2及BAGE基因在卵巢癌组织中的表达率相对较低，但在浆液性囊腺癌中仍有相对较高的阳性表达率(表3)。表4  MAGE、BAGE、GAGE表达与卵巢癌临床

    3  讨  论

    目前已发现MAGE基因有23个家族成员，均定位于人X染色体上，在多种肿瘤中有较高程度的表达。其编码的氨基酸超过300个，分解产生的肽段可与各种白细胞抗原结合，形成能被自体T淋巴细胞识别的复合物。GAGE基因家族至少有8个近源基因，均定位于X染色体上，其中GAGE1、GAGE2基因表达产生抗原肽段YRPRPRRY与HLACw*0601结合的复合物可以被激活的细胞毒性T淋巴细胞识别［2］。除早期的BAGE基因家族外，目前又发现5个新的BAGE基因，均定位于13和21号染色体的着丝粒旁，此外有9个BAGE基因节段位于第9、13、18和21号染色体着丝粒旁区域，BAGE基因编码产生含43个氨基酸的多肽，其中 AARAVFLAL 片段与HLACw*1601分子结合，被激活的细胞毒性T淋巴细胞识别。上述基因和基因节段具有高度同源性（90％ 99％）。

    基因性肿瘤标记物研究表明，多数不同类型卵巢癌表达BAGE、MAGE1/3、GAGE1／2，而正常卵巢组织和体液表达阴性。Russo等［3］用RTPCR方法测试54例上皮性卵巢癌MAGE1和MAGE3的转录水平，结果表达率分别为28％和17％，BAGE和GAGE的阳性表达率为15％和31％，且MAGE1的表达随肿瘤临床分期增加而升高（MAGE1在Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌的表达率分别为22％和43％）。Gillespie等［4］研究发现，MAGE1在卵巢癌中的表达率为56％，而MAGE2、3、4，BAGE，GAGE阳性表达率相对较低。Hofmann等［2］检测卵巢癌腹水标本，56％(15／27)的BAGE mRNA为阳性，MAGE1 mRNA为7％(2／27)，MAGE3 mRNA为30(8／27)，GAGE1／2为30％(8／27)，其联合检测敏感性94％，特异性亦94％，仅1例假阳性。因此认为，检测腹水BAGE、GAGE和MAGE的 mRNA为一有潜力的卵巢癌诊断方法。

本研究中正常卵巢组织中MAGE、GAGE、BAGE基因无表达，良性肿瘤中仅有MAGE1基因表达，阳性率为15％（3/20）。卵巢癌组织标本中MAGE1、MAGE3的表达率较高，分别为51.1％（25/47）和34％（16/47），MAGE1表达率略低于Gillespie等［4］的研究结果。而GAGE1/2及BAGE基因在卵巢癌中的表达率分别为25.5％（12/47）、14.9％（7/47），明显高于Gillespie等［4］的研究结果。卵巢癌转移灶中仅有MAGE1、BAGE基因表达，阳性表达率分别为28.6％（2/7）、14.3％（1/7）。浆液性囊腺癌中的MAGE1、MAGE3基因阳性表达率明显高于其它类型卵巢恶性肿瘤(P＜0.05)。进一步对MAGE、GAGE、BAGE基因的表达情况与47例卵巢癌临床资料进行统计分析，结果发现基因的表达与是否绝经及有无淋巴结转移无关，而MAGE1、MAGE3基因的阳性表达与细胞分化程度及肿瘤临床分期密切相关(P＜0.05)，组织分化程度越低，临床分期越晚，其表达率越高。提示，MAGE1、MAGE3基因与卵巢癌恶性程度及预后密切相关，可作为一个独立的肿瘤预后监测指标。伴有腹水的卵巢癌患者BAGE表达的阳性率较高(P＜0.05)，这与Hofmann等［2］的研究结论（56％的BAGE mRNA为阳性）相一致，提示BAGE可能与腹水的形成及发展有关。此外，本研究中MAGE、GAGE、BAGE基因在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1中的表达，进一步验证了这些基因在肿瘤诊断中的作用。有研究表明用MAGE基因产物制造的疫苗具有可接受的毒性，在不配伍其他治疗措施的情况下肿瘤也有较好反应［6］。MAGE3基因已经在基因芯片中作为一个可靠标志来检测外周血中黑色素瘤细胞的存在，也可能用来监视肿瘤细胞浸润生长的状态，以便提供合适的治疗干预措施［6］。  

    MAGE、BAGE、GAGE家族基因表达产物为肿瘤特异性抗原，不同组织类型的肿瘤中均有较高的阳性表达率，因此在肿瘤免疫治疗的研究中倍受关注。目前关于MAGE、BAGE、GAGE在卵巢癌疫苗应用研究中较为普遍的是肽疫苗和DC疫苗［7，8］。尽管近年来国内外许多学者对该族基因尤其是MAGE进行了大量的研究，也取得了不少成果，但认识仍不够充分。由于肿瘤细胞的异质性，不同类型的卵巢肿瘤或同一肿瘤的不同部位MAGE、BAGE、GAGE家族成员的表达存在差异，如何选择免疫治疗的靶抗原存在很大的困难［9］。通过本研究，我们认为MAGE、BAGE、GAGE作为卵巢癌分子标志以及肿瘤免疫治疗特异性靶位，尚需要更深入的探讨。

【参考文献】  ［1］ Van der Bruggen P， Traversari C, Chomze P， et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma［J］. Science, 1991, 254(5038):1?6431?647.

［2］ Hofmann M, Ruschenburg I. mRNA detection of tumorrejection genes BAGE, GAGE, and MAGE in peritoneal fluid from patients with ovarian carcinoma as a potential diagnostic tool［J］. Cancer Cytopathology, 2002, 96(3):187193.

［3］ Russo V, Dalerba P, Ricci A, et al. MAGE, BAGE and GAGE genes experiences in fresh epithelial ovarian carcinomas［J］. Int J Cancer, 1996, 67(3):457460.

［4］ Gillespie AM， Rodgers S， Wilson AP, et al. MAGE, BAGE and GAGE： tumor antigen expression in begin and malignant ovarian tissue［J］. Br J Cancer, 1998, 78(6):816821.

［5］ Figueiredo DL, Mamede RC, ProtoSiqueira R, et al. Expression of cancer testis antigens in head and neck squamous cell carcinomas ［J］. Head Neck, 2006, 10(2):132137.

［6］ Ito S, Kawano Y, Katakura H, et al. Expression of MAGED4, a novel MAGE family antigen, is correlated with tumorcell proliferation of nonsmall cell lung cancer［J］. Lung Cancer, 2006, 51(1):7988.

［7］ Chitale DA, Jungbluth AA, Marshall DS， et al. Expression of cancertestis antigens in endometrial carcinomas using a tissue microarray［J］. Mod Pathol, 2005, 18(1):119126.

［8］ 李 芳, 朱怀仕, 贾 平,等.卵巢癌患者自体肿瘤细胞疫苗的临床应用［J］.中华妇产科杂志，2004，39（1）:5152.

［9］ Ma Z, Khatlani TS, Ohno K, et al. Cloning and sequencing of canine MAGE cDNA［J］. Tissue Antigens, 2000, 56(2):166169.