化疗药物诱导后乳腺肿瘤细胞钙离子浓度变化的检测
发表时间：2009-06-23 浏览次数：533次
作者:张向阳 作者单位：河北工程大学临床医学院中心实验室, 河北 邯郸 056029 【关键词】 激光扫描共聚焦显微镜 乳腺肿瘤 钙离子
细胞内游离钙离子浓度的变化是导致细胞生理功能变化的重要物质基础，也是多种受体激动后信息传递过程的中心环节。2004年11月 2006年2月，我们对30例乳腺肿瘤组织细胞用五种化疗药物诱导后，采用激光扫描共聚焦显微镜［13］检测乳腺肿瘤细胞钙离子浓度变化，并与常规MTT比色法的药敏结果比较，探讨使用激光扫描共聚焦显微镜检测化疗药物诱导后乳腺肿瘤细胞钙离子浓度变化的临床意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料 30例均为本校附属医院诊治的乳腺肿瘤患者， 35 60岁，平均42.8岁。细胞标本均来源于手术切除的新鲜肿瘤组织。
1.2 试剂和仪器 MTT(美国Sigma)；RPMI1640(美国Gibco)；Flou3/Am(美国Biotium)；二甲基亚砜（DMSO,天津市瑞金特化学品有限公司）；顺铂(DDP,山东省德州制药厂，批号030401)，甲氨蝶呤(MTX,北京医科大学实验药厂，批号040101)，阿霉素(ADM,明治医药有限公司，批号030304)，丝裂霉素(MMC,上海新亚药业有限公司，批号040409)，5氟尿嘧啶(5Fu,上海旭东海普药业有限公司，批号031206)；激光扫描共聚焦显微镜MRC1024(美国BioRad)；二氧化碳培养箱（日本SANYO）；酶联免疫检测仪DG3022型（华东电子管厂）。
1.3 检测方法 每例细胞标本分成五份，分别加入顺铂（浓度为720?μg/ml）、甲氨蝶呤（浓度为150?μg/ml）、阿霉素（浓度为250?μg/ml）、丝裂霉素（浓度为50?μg/ml）和 5氟尿嘧啶（浓度为2.4?mg/ml），置37?℃、5%CO2的培养箱中，培养12?h后，收集部分细胞液，1?000?r/min 离心5?min，将获得的细胞加入50?μl钙高度特异性荧光指示剂Flou3/Am(浓度为10?μmol/L), 37?℃孵育1?h，洗去多余的Fluo3/AM，用激光扫描共聚焦显微镜（激发波长488?nm,发射波长526?nm）检测细胞内钙离子浓度变化。细胞培养72?h后，收集剩余部分细胞液，将获得的细胞加入20?μl的MTT（浓度为2?mg/ml）,继续培养4?h，然后加入二甲基亚砜150?μl，室温振荡10?min，用酶标仪（λ=550?nm）测定每孔吸光度（A）值。相对抑制率=（对照组A-加药组A）/对照组A×100%，相对抑制率≥30%为敏感，相对抑制率＜30%为不敏感。
2 结 果
化疗药物引起的乳腺肿瘤细胞内钙离子浓度的变化与药敏的关系见表1。由表1可见，敏感药物引起的乳腺肿瘤细胞内钙离子的浓度变化明显大于不敏感药物，敏感药物与不敏感药物引起的乳腺肿瘤细胞内Ca2+浓度变化具有显著差别（P＜0.05）。
MTT比色法敏感例数不敏感例数2250% 2440% 2530% 131220% 15＜20%18
3 讨 论
MTT比色法已广泛用于临床抗癌药物筛选研究，并开始用于新鲜肿瘤细胞的药物敏感性检测，使肿瘤化疗方案的个体化初步得以实现［4］，但MTT比色法所需时间长，即使应用改进的MTT比色法也需3天时间，在药敏结果出来之前，患者所用的化疗药物常需靠经验选定。目前所用的抗癌药均可在同类型的敏感肿瘤细胞中诱导凋亡，药物的抗癌效果不仅取决于药物对靶细胞的直接作用，更在于其诱导肿瘤细胞凋亡的能力，诱导肿瘤细胞凋亡可能是许多化疗药物抑制肿瘤的生长机制之一，肿瘤生长的主要原因不是肿瘤细胞大量增殖的结果，而是细胞凋亡抑制剂或肿瘤促进剂延长了已转化的细胞生存期限的结果，基于此观点，有人提出肿瘤化疗的目标是诱导细胞凋亡［5］。钙离子浓度变化是细胞凋亡时的特征，发生凋亡的细胞最早可以测及的生物变化是细胞内快速持续的钙离子浓度的升高，有研究表明［6］，化疗药物作用肿瘤细胞约12小时，钙离子浓度相对稳定。本研究结果显示，能使乳腺肿瘤细胞的钙离子浓度发生较大变化的化疗药物，MTT法药敏检测的结果更易呈敏感性。因此，使用激光扫描共聚焦显微镜检测乳腺肿瘤细胞内钙离子浓度变化，可以在MTT药敏结果出来之前，为选择乳腺肿瘤化疗敏感药物提供参考。
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［4］ 王 宏，潘世扬，陈燕华，等.常用化疗药物对不同组织类型非小细胞肺癌体外药敏实验［J］.江苏医药，2005, 31(10):721722.
［5］ 彭黎明，王曾礼主编.细胞凋亡的基础与临床［M］.北京：人民卫生出版社，2000.258260.
［6］ 邢承忠，陈峻青. 细胞内游离Ca2+和cAMP浓度在胃癌细胞凋亡过程中的变化特点［J］.中国肿瘤临床，1999,26(5):355357.
