孕妇血中胎儿DNA荧光定量PCR检测及与临产关系
发表时间：2009-06-23 浏览次数：466次
作者:张怡梅,柳林,王修海
作者单位：青岛大学医学院生物学教研室，山东 青岛 266021
【摘要】 目的 探讨晚孕期和临产后母血中胎儿DNA含量的变化及其临床意义。方法 运用实时荧光定量PCR技术分别检测孕28～42周以及临产时孕妇血浆中胎儿DNA的含量并进行比较。结果 孕28～31周、孕32～35周、孕36～42周和临产时的母血浆中胎儿DNA的平均含量比较差异有显著性(F=308.19,q=11.59～40.33,P<0.01)。结论 随着孕期的进展，母血中胎儿DNA含量的升高可能是分娩的诱因之一。
【关键词】 孕妇；胎儿;DNA;聚合酶链反应
FETAL DNA IN MATERNAL PLASMA AND ITS RELATION WITH PARTURIENT PERIOD
ZHANG YIMEI, LIU LIN, WANG XIUHAI
(Department of Biology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China);
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the changes of content of fetal DNA in maternal plasma in late pregnancy and in labor, and explore their significance.MethodsThe content of fetal DNA in maternal plasma in 28-42 weeks of gestation and parturient period were detected by using realtime quantitative PCR technique.ResultsThe differences of mean content of fetal DNA in maternal plasma among 28-31week, 32-35week, and 36-42week gestation and parturient period were significant (F=308.19,q=11.59－40.33,P<0.01).ConclusionWith the progress of duration of pregnancy, the fetal DNA in maternal blood increases, which is, most likely, one of the inducements leading to delivery.
［KEY WORDS］Pregnant; Women fetus; DNA; Polymerase chain reaction
研究结果显示，孕妇血浆中存在胎儿DNA,且发现随着孕期的进展，胎儿DNA的含量也会相应升高[1]。但是对于母血中胎儿DNA含量的升高是否导致了临产的发生，它与临产及分娩是否有着密切的关系，文献报道较少。本研究旨在应用荧光定量PCR技术，检测母血中胎儿DNA含量的变化规律，从而在分子水平上探讨母血中胎儿DNA的变化及其与临产之间的关系。
1 对象与方法
1.1 对象
2006年10月～2007年4月，选择在潍坊市人民医院产科就诊的正常孕育男胎的孕妇40例，分为28～31周组、32～35周组、36～42周组、临产组。正常临产是指孕妇孕龄36周以上，阴道少量见红，或伴有规律性子宫收缩，或见阴道流水，不伴有任何妊娠并发症。对被研究对象进行定期随访，并征得病人的同意，等待产后确认胎儿的性别。同时，选取1例正常男性血浆和 1 例未孕、无妊娠史的女性血浆分别作为阳性和阴性对照。
1.2 方法
1.2.1 标本的准备
取各组孕妇外周血3 mL，用EDTA抗凝，12 000 r/min离心10 min，取血浆放在灭菌离心管内，再次3 000 r/min离心10 min，取上清于另一灭菌离心管中，-30 ℃保存。
1.2.2 血浆DNA的提取
采用Tiangen公司的微量DNA提取试剂盒，按照步骤及要求操作。所有步骤均由女性操作。
1.2.3 实时荧光定量PCR引物及探针的设计
采用美国ABI公司生产的Tagman荧光探针试剂盒，分别对Y染色体上的DYS14位点进行定量分析。DYS14片段大小为84 bp, DYS14引物上游序列: 5′GGGCCAATGTTGTATCCTTCTC3′； DYS14引物下游序列：5′GCCCATCGGTCACTTACACTTC3′； DYS14 探针序列: 5′TCTAGTGGAGAGGTGCTC3′。
1.2.4 实时荧光定量PCR检测
标准曲线的建立和结果计算：按照10倍梯度稀释标准品，进行PCR扩增。各个梯度之间循环阈值(Ct)相差3～4个循环。然后，给每个梯度的标准品输入相应的拷贝数，以拷贝数为横坐标，Ct 值为纵坐标，建立标准曲线，从标准曲线可以得出Ct值与拷贝数之间的转换关系，即利用待测标本的Ct值求出相应的DNA含量，此工作由Applied Biosystems 7500 Sequence Detector所带SDS软件自动完成。实时定量PCR反应体系的建立和靶序列的扩增：反应体系总体积20 μL，内含20×Primermix 1 μL，ddH2O 7 μL，DNA模板1 μL， 2×Tagman Universal Master Mixture (ABI公司)10 μL，荧光探针与引物1 μL。采用ABI公司的PE 7500实时荧光定量PCR仪。PCR反应条件为：50 ℃ 1 min,95 ℃ 10 min后，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。为增加数据的可信度，每份标本为3管检测，结果取平均值。
2 结果
通过稀释法，定量地检测男性Y染色体的DYS14基因，所有怀男胎的孕妇均检测到阳性结果，但作为对照的女性外周血细胞DNA始终为阴性。孕28～31周组、孕32～35周组、孕36～42周组、临产组孕妇血浆中DNA的含量拷贝数分别为（230±69）、（480±55）、（800±70）、（1 100±77）/mL。各组间孕妇外周血中胎儿DNA的含量比较,差异有显著意义(F=308.19,q=11.59～40.33，P<0.01)。
3 讨论
随着分子生物学技术的发展，LO等[1]用定量PCR技术对体外受精孕妇的血浆连续性检测显示，最早在孕7周即可从母血浆中测到胎儿DNA存在,并对不同孕周的孕妇血浆进行SRY基因检测，结果显示，胎儿DNA的含量随孕周增加而增加。CHAN等[2]对26例孕晚期(35～42周)孕妇血循环中胎儿DNA分析显示，在妊娠晚期胎儿DNA量迅速增加，平均每周增加29.3％，且DNA的含量与孕周之间有显著相关性。本研究对40例处于不同妊娠期的孕妇外周血的胎儿DNA的检测结果说明，随着妊娠时间的增加，胎儿DNA的含量增加,与CHAN等[2]的研究结果相同。
目前，母血中胎儿DNA确切来源尚不清楚。对胎儿DNA来源的推测包括来源于母血循环中受母体免疫系统破坏的胎儿细胞，胎儿发育过程中凋亡的细胞，或是凋亡的滋养细胞[3,4]。在分娩前几周的母血中胎儿DNA水平迅速升高，与此同时伴随胎盘老化滋养细胞凋亡增加并释放大量DNA。也有学者观察到在母血循环中的很多胎儿有核红细胞以凋亡形式存在，最终释放DNA分子片段，因此推断这些存在于母血循环中的造血细胞和滋养细胞的凋亡是母血中胎儿DNA来源之一。还有研究认为，胎儿DNA在母血浆中不断被代谢清除，同时母血浆中总DNA含量随妊娠时间增加而升高[5]。而这种释放到母血中的胎儿DNA是否仍有活性尚不清楚[6]。
本研究结果显示，随着孕周的增加，母血中的胎儿DNA的含量也升高，临产后母血中胎儿DNA的含量在整个妊娠过程中达到最高，说明胎儿DNA含量升高可能是诱发临产的机制之一。一般认为，妊娠晚期随着胎儿的成熟，宫腔内容积增大，宫腔压力增加，子宫动静脉中的血流量加大，母体与胎儿之间的血液交换也随着胎盘的长度、厚度及表面积的增加而增加,从而导致胎儿的有形成分逐渐增多并运输到母体血循环中。同时胎盘老化，滋养细胞凋亡增加，母体和胎儿之间的屏障完整性遭到破坏，也会导致更多的胎儿成分释放到母血中。在对一些病理性妊娠疾病的研究中显示，如羊水过多则母体血浆中胎儿DNA的含量升高，而其发病的胎盘因素考虑是胎盘血管丰富，渗透面积大导致的[7,8]。另一方面，现代医学认为妊娠是一种自然同种异体移植现象, 胚胎带有父亲抗原，与母亲为同种半抗原的免疫关系，如同种异体移植，胎儿在妊娠期内不受母体免疫排斥,与胎盘组织的免疫屏障、胎膜细胞抑制细胞对胎儿组织的杀伤、母体免疫抑制细胞及免疫抑制物的作用有关。随着妊娠期的进展，这种免疫平衡失调，胎儿与母体之间的滋养层细胞受到母体免疫性损伤，远端毛细血管坏死、破裂出血，引发胎盘剥离，从而导致临产的发生。而这种胎盘滋养细胞凋亡增加引起了更多的胎儿成分释放入母血中[9]。如在妊娠期高血压综合征、母儿RH血型不合的研究中，都发现了母血浆中胎儿DNA含量升高，这两种疾病的诱因都有母体和胎儿之间的免疫屏障破坏等方面的因素。本研究结果也表明，胎儿DNA在临产时达到最高，分析认为这种胎儿DNA水平的升高，最终破坏母胎间的免疫平衡，导致临产及分娩的发生，从分子水平进一步丰富了分娩的发生机制，为临床提供了有效的参考指标，具有较高的临床价值。
本研究用实时荧光定量PCR的方法检测了母体内胎儿DNA的含量，而这种胎儿的DNA成分有可能作为半抗原，激活母体免疫系统，导致临产的发生。对于这种胎儿DNA的成分是否具有一定生物学功能，以及胎儿母体之间怎样的相互作用，还有待于进一步的研究。
用于母血中胎儿DNA检测的方法很多，由于胎儿DNA的含量极少，常规PCR扩增效果较差，利用巢式PCR扩增有助于提高检测的敏感度。实时荧光定量PCR技术凭借其具有的实时监测、快速、灵敏和精确等优点，已经逐步取代常规PCR检测，从孕妇血浆中检测胎儿基因的准确性几乎可达100％[10]。在实时荧光定量PCR检测胎儿基因序列时，常选择男性胎儿Y染色体上的一个基因片段，如SRY基因、DYS1基因等。本研究采用DYS14基因，在扩增24个循环时即检测到了胎儿DYS14基因，检出率为100%，并且DYS14基因为多拷贝基因[11]，检出率高于其他基因序列，容易在临床及科研中普及应用。
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