RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响

作者:杜鹃,陈爱平,宋旭霞,刘晖

作者单位：青岛大学医学院，山东 青岛 266003

     【摘要】  目的 构建表皮生长因子受体(EGFR)基因的小干扰RNA（siRNA）质粒，转染人卵巢癌细胞株skov3后检测RNA干扰（RNAi）对EGFR基因表达及细胞对化疗药物敏感性的影响。方法 体外构建EGFR小发卡状RNA（shRNA）的表达质粒，脂质体法介导将其转染入skov3细胞。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测EGFR mRNA的表达，使用免疫细胞化学法(ICC)检测EGFR蛋白的表达。使用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定EGFR shRNA转染skov3细胞后细胞对顺铂敏感性的改变。结果 EGFR shRNA转染组细胞EGFR mRNA的表达与其他两组相比明显减弱（F=87.73，q=16.81、15.33,P<0.01）,EGFR蛋白表达明显下调（F=69.29，q=14.71、13.57，P<0.01）；顺铂敏感性比正常对照组提高了约3倍。结论 靶向EGFR基因的序列特异性shRNA可有效抑制skov3细胞中EGFR基因的表达，增强skov3细胞对顺铂的敏感性。

【关键词】  卵巢肿瘤;受体,表皮生长因子;RNA干扰;顺铂

　　EFFECT OF SILENCING EGFR GENE EXPRESSION BY RNA INTERFERENCE ON THE CHEMOSENSITIVITY OF OVARIAN CANCER CELL LINE skov3

　　DU JUAN, CHEN AIPING, SONG XUXIA, et al

　　(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); 　　［ABSTRACT］ObjectiveTo construct expression vector of EGFR specific siRNA and transfect it into human ovarian cancer cell line skov3 and then investigate the effect of RNA interference (RNAi) on the target gene expression and chemosensitivity of the cell line.MethodsEGFR shRNA was synthesized in vitro and then transfected into skov3 cell to set up the EGFR shRNA transfectant cell line. The normal control cell line and nonspecific transfectant cell line were also included in the study. RTPCR and immunocytochemistry were performed to detect the inhibitive effect of RNAi on mRNA level and protein level, respectively. The chemosensitivity to cisplatin was detected by MTT method.ResultsThe expression of EGFR mRNA of sequence specific shRNA targeting EGFR was obviously downregulated (F=87.73；q=16.81,15.33；P<0.01) and the same happened to the protein expression (F=69.29；q=14.71,13.57；P<0.01), while the chemosensitivity to cisplatin was increased by three times.ConclusionThe EGFR specific shRNA expression vector can effectively suppress the expression level of EGFR gene of skov3 cells, and increases its chemosensitivity to cisplatin.

    ［KEY WORDS］Ovarian neoplasms; Receptor, epidermal growth factor; RNA interference; Cisplatin

    卵巢癌是目前病死率最高的妇科恶性肿瘤，多数病人就诊时已至晚期，应用传统的手术加放化疗的方式治疗，5年生存率仅为30％左右[1]。卵巢癌的病理类型繁多，其中上皮性卵巢癌是最常见的类型。表皮生长因子受体（EGFR）高表达于上皮性癌组织[2]，研究发现原发性卵巢癌中EGFR的表达率为35%～70%，EGFR的过表达与癌症的发生发展密切相关。本研究以EGFR为靶点，以RNA干扰技术为指导，将干扰质粒转染人浆液性卵巢癌细胞株skov3，观察其对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响，为探索以EGFR为靶向的卵巢癌基因治疗奠定体外研究的基础。

1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  细胞株和菌株

　　人浆液性卵巢癌细胞株skov3由华西医科大学馈赠；大肠杆菌DH5α由青岛大学医学院微生物学教研室保存。

　　1.1.2  主要试剂及来源

　　pSilencer 2.1U6 neo 购自Ambion公司；Reverse Transcriptin System 试剂盒购自Promega公司；Hifectin Ⅱ购自普利莱公司；兔抗人EGFR一抗、HRP标记羊抗兔IgG二抗购自北京中杉公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、dNTP 均购自上海生工公司；顺铂为齐鲁制药冻干型制剂。

　　1.2  方法

　　1.2.1  EGFR基因shRNA寡核苷酸序列的设计与合成

　　利用Ambion公司在线设计程序，选取EGFR基因cDNA序列起始点280个核苷酸之后的连续19nt作为RNA干扰的特异性序列，并经Blast同源性比较分析。设计为能表达其发卡结构的小RNA（shRNA）的DNA序列，两端加上BamHⅠ、HindⅢ酶切位点。Sense：5′GATCCGCACAGTGGAGCGAATTCCTTTCAAGAGAAGGAATTCGCTCCACTGTGTTTTTTGGAAA3′,Antisense：5′AGCTTTTCCAAAAAACACAGTGGAGCGAATTCCTTCTCTTGAAAGGAATTCGCTCCACTGTGCG3′。委托上海生工公司合成。

　　1.2.2  EGFR shRNA真核表达质粒的构建、鉴定和纯化

　　将上述两条寡核苷酸链退火形成双链，再与线性化质粒pSilencer 2.1U6 neo连接，取名为pEGFRshRNA。转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选，挑选阳性克隆并提取质粒，经BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，并测序证实插入序列为所设计的发卡序列。按PureYield Plasmid Midiprep System试剂盒的步骤提取并纯化质粒待转染。

　　1.2.3  细胞培养

　　skov3细胞在含体积分数为0.10 的胎牛血清、105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RMPI 1640培养液中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中常规培养。每天观察记录细胞的生长状态。

　　1.2.4  转染

　　采用HifectinⅡ转染试剂转染，按操作说明优化转染条件。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。正常对照组细胞不进行任何干预；非特异性转染组转染由Ambion公司质粒试剂盒所提供的非特异性质粒；特异性转染组转染pEGFRshRNA质粒。转染前1 d将细胞接种至6孔板，每孔5×105个细胞，转染当天细胞约80％汇合，将构建好的质粒与HifectinⅡ混合成转染复合物(质粒质量∶HifectinⅡ体积= 1∶1.5),加入细胞中轻柔摇匀，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育24 h后1∶2传代，加300 mg/L的G418筛选，3周后获抗G418的阳性克隆，继续扩增培养用于后续实验。

　　1.2.5  RTPCR检测转染前后skov3细胞EGFR mRNA的表达

　　按Trizol试剂说明书的要求提取细胞总RNA，按Reverse Transcription System的说明书采用特异性下游引物法反转录成cDNA。EGFR上游引物：5′AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT3′；EGFR下游引物：5′GGAAGTCCATCGACATGTTGCT3′,扩增产物长262 bp。以βactin为内参照，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环25次后，72 ℃延伸10 min。15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射观察仪观测、照相，用Band Scan图像分析软件对结果进行分析，以EGFR与βactin相对比值比较各组细胞EGFR mRNA的表达差异。

　　1.2.6  免疫细胞化学法（ICC）检测转染前后skov3细胞EGFR蛋白的表达

　　常规细胞爬片后用丙酮室温固定10～15 min，体积分数为0.03 H2O2封闭内源性过氧化物酶，加兔抗人EGFR一抗（1∶60稀释）37 ℃孵育1 h，然后再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗在37 ℃孵育30 min, DAB显色、苏木精复染后树胶封片，在显微镜下观察并照相。

　　1.2.7  化疗敏感性分析

　　细胞制成单细胞悬液后以每孔5×103接种于96孔培养板，待24 h细胞贴壁后改换含0～64 mg/L不等浓度的顺铂溶液100 μL，继续培养48 h。用MTT法在490 nm波长处测定各组细胞吸光度值，以顺铂的药物浓度为横轴，细胞的存活率为纵轴，计算各组细胞的半数抑制浓度（IC50），每个浓度作3个平行孔。

1.2.8  统计学分析

　　使用SPSS 10.0 统计软件包。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。

　　2  结 果

　　2.1  质粒的鉴定

    质粒双酶切产物琼脂糖凝胶电泳出现两条带，条带的位置与推断相符。质粒的测序结果证明插入片段的序列完全正确。

　　2.2  pEGFRshRNA对细胞EGFR mRNA表达的影响

    电泳结果显示，约在262 bp处见扩增条带（图1）。用Band Scan图像分析软件对结果进行分析，以EGFR与βactin比值来表示EGFR mRNA的相对表达数值，正常对照组为3.86±0.13，非特异性转染组为3.68±0.33，特异性转染组为1.84±0.33。其中正常对照组与非特异性转染组相比差异无统计学意义（F=87.73,q=1.50,P>0.05），特异性转染组与前两组相比差异有显著性（q=16.81、15.33,P<0.01）。与正常对照组相比，特异性转染组细胞EGFR mRNA的抑制率达51%。

　　2.3  pEGFRshRNA对细胞EGFR蛋白质表达的影响

    免疫细胞化学染色法显示，skov3细胞胞膜和胞浆中有EGFR蛋白表达，显微镜下见胞膜和胞浆有棕褐色颗粒沉着，利用Image Plus图像分析软件对结果进行分析，特异性转染组细胞EGFR蛋白表达明显比其他两组下降（F=69.29，q=14.71、13.57，P<0.01），而非特异性转染组与正常对照组相比未见明显减弱（q=1.14,P>0.05）。

　　2.4  顺铂敏感性

    MTT分析结果显示，暴露于顺铂48 h后，三组细胞存活率均随顺铂浓度的增加而降低，其中特异性转染组降低最为显著（图2）。正常对照组IC50为(12.43±0.23)mg/L，非特异性转染组为(11.56±0.28)mg/L，特异性转染组为(3.12±0.16)mg/L，pEGFRshRNA转染后的skov3细胞对顺铂的敏感性提高了约3倍。

　　3  讨论

    EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，在很多实体瘤组织中过表达[3]。基因突变、扩增和蛋白过表达是EGFR异常作用的机制。在卵巢癌中组织EGFR突变的发生率较低，而扩增较多见。STADLMANN等[4]对80例浆液性卵巢癌病人癌组织的研究显示，20%卵巢癌组织中EGFR基因高表达，而仅1例有基因突变，蛋白的表达与基因的扩增有相关性。LASSUS等[5]报道，EGFR突变少见于浆液性卵巢癌，EGFR扩增和过表达更为常见，并且与疾病的侵袭性及病人的不良预后有关。这些发现使得EGFR的扩增成为研究EGFR抑制剂对卵巢癌作用临床试验挑选病人的一个潜在的标准，并为卵巢癌的靶向治疗提供了有力的依据。

    RNAi的发现为肿瘤的研究和治疗提供了一种特异性的新策略，将双链RNA寡核苷酸导入细胞后，只与同源mRNA互补结合并使之降解，沉默同源特异基因的mRNA，而其他的mRNA表达并不受影响，微量siRNA 即可表现高效类似于基因敲除的效果。在非小细胞肺癌、头颈部恶性肿瘤中利用此方法对EGFR基因的靶向研究比较成熟，被干扰的肿瘤细胞出现生长抑制、凋亡增加、侵袭性下降及对化疗药物敏感性增强的现象[6]。

    铂类药物是卵巢上皮性癌首选化疗药，顺铂是铂类药物的一种，是细胞周期非特性抗肿瘤药物，广泛应用于卵巢癌的临床治疗，它能与DNA上的碱基结合形成交叉联结，从而破坏DNA的结构和复制功能，同时它还能激活胞浆和胞核内的某些信号转导途径，参与调控细胞周期、破坏细胞修复和介导程序性死亡。BENHAR等[7]研究顺铂和EGFR的关系显示，此药在抑制肿瘤细胞生长的同时，能够使卵巢癌EGFR表达增加。并且这种作用不依赖于配体EGF，抑制EGFR的激活可以增强顺铂对细胞的毒性，他认为EGFR的异常激活是细胞对顺铂作用后的一种生存应激反应。

    肿瘤细胞的化疗敏感性是决定抑瘤效果的关键因素，DNA修复是细胞对化疗药的一种抵抗机制，PARK等[8]将化疗药物敏感和药物抵抗的卵巢癌细胞作对比，显示这两种细胞中参与药物损伤DNA修复的蛋白质表达没有明显的差异，却显示EGFR与细胞对药物的抵抗性相关，药物不敏感或抵抗的细胞EGFR水平升高，药物敏感的细胞EGFR的表达则较低。DAI等[9]对此现象进行研究，结果表明EGFR小分子抑制剂可以通过抑制DNA的修复功能和抑制细胞的增殖来协同化疗药物对细胞的毒性作用。他们将酪氨酸激酶（下转第34页）（上接第31页）抑制剂Erlotinib作用于耐药性卵巢癌细胞，显示能够有效提高这些细胞对化疗的敏感性。

本实验根据RNAi原理体外合成并构建EGFR干扰质粒pEGFRshRNA，脂质体法将其转染入人卵巢癌细胞系skov3，用RTPCR和ICC证明干扰质粒能够有效抑制skov3细胞EGFR的表达，提高癌细胞对顺铂的敏感性，为卵巢癌的基因治疗和克服化疗耐药提供新思路。

【参考文献】  　　[1]SOOD A K, ABURUSTUM N R, BARAKAT R R, et al. Fifth international conference on ovarian cancer: challenges and opportunities[J]. Gynecol Oncol, 2005,97:916923.

　　[2]HERBST R S. Review of epidermal growth factor receptor biology[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004,59(2 Suppl):2126.

　　[3]姜天福,魏志敏,刘祖华. 子宫颈及子宫内膜肿瘤组织EGFR和cerbB2的表达及其意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2004,40(1):519.

　　[4]STADLMANN S, GUETH U, REISER U, et al. Epithelial growth factor receptor status in primary and recurrent ovarian cancer[J]. Mod Pathol, 2006,19:607610.

　　[5]LASSUS H, SIHTO H, LEMINEN A, et al. Gene amplification, mutation, and protein expression of EGFR and mutations of ERBB2 in serous ovarian carcinoma[J]. Mol Med, 2006,84：671681.

　　[6]NAGY P. Small interfering RNAs suppress the expression of endogenous and GFP fused epidermal growth factor receptor (erbB1) and induce apoptosis in erbB1 over expressing cells[J]. Exp Cell Res, 2003,285：3949.

　　[7]BENHAR M, ENGELBERG D, LEVITZKI A. Cisplatininduced activation of the EGF receptor[J]. Oncogene, 2002,8(21)：87238731.

　　[8]PARK S J, ARMSTRONG S, KIM C H, et al. Lack of EGF receptor contributes to drug sensitivity of human germline cells[J]. Br J Cancer, 2005,92:334341.

　　[9]DAI Q, LING Y H, LIA M, et al. Enhanced sensitivity to the HER1/epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor erlotinib hydrochloride in chemotherapyresistant tumor cell lines[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(4)：15721578.