66例乳腺癌的分子病理学研究

作者:徐虓,马斌林,耿中利,王进   作者单位：新疆医科大学， 新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺头颈外科, 新疆乌鲁木齐830011

    【摘要】  　　目的：研究人类乳腺癌组织中与张力蛋白同源第10号染色体缺失的磷酸酶基因（PTEN）和过氧化物酶体增长因子活化受体γ（PPARγ）蛋白及其与相关分子病理学指标表达的关系和临床意义，为乳腺癌的分子病理分型提供基础研究依据。方法：随机选取我院临床证实66例乳腺癌患者的临床资料及病理切片，利用免疫组织化学链霉素抗生物素过氧化物酶（SP）法检测乳腺癌组织中PTEN、PPARγ、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、Her2蛋白的表达，分析乳腺癌组织中PTEN和PPARγ蛋白表达与患者淋巴结转移率及Her2、ER、PR表达之间的关系。结果：乳腺癌组织中PTEN和PPARγ蛋白表达阳性率分别为68.2％、63.6％，PTEN阳性表达主要在细胞核内，占72.86%，胞浆占27.14％，PPARγ阳性表达在核膜占87.3％。相关分析表明PTEN与PPARγ、ER、PR、HER2表达无显著相关（P均＞0.05），PPARγ与ER、PR、HER2表达无显著相关（P均＞0.05）。PTEN阳性表达乳腺癌患者淋巴结转移率为48.97％，阴性表达淋巴结转移率为46.04％。PPARγ阳性表达乳腺癌患者淋巴结转移率为53.96％，阴性表达淋巴结转移率为43.64％。结论：PTEN、PPARγ可能作为独立的乳腺癌预后标记物，对乳腺癌生物治疗和临床预后提供依据。

【关键词】  乳腺癌; 与张力蛋白同源10号染色体缺失的磷酸酶基因; 过氧化物酶体增长因子活化受体γ; 免疫组织化学; 分子病理学

　　A molecule pathology study in human breast cancer

　　XU Xiao, MA Binlin,   GENG Zhongli,   et al

　　(Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective:  To study the function and the clinical significance of  expression of PTEN , PPARγ and its correlations with related molecule pathology index in human breast cancer (HBC). In order to give a basic data for molecule pathology typing. Methods:  Sixty six HBC cases were collected randomly, Streptaviin perxidse immuno histochemistry was used. The relationship between expressions of PTEN,  PPARγ， Her2, ER, PR，and matastasis rate of lymph node were analysed. Results:  The positive rate of  PTEN and PPARγ expression  in HBC were 68.2% and 63.6% respectively. For PTEN, 72.86% was nuclear expression. Normal expression was 27.14%. The normal expression of PPARγ was 87.3%. Correlation analyzation showed that there had no relationship between PTEN and PPARγ, ER, PR, HER2 （P＞0.05）,  also,  so did between PPARγ and ER, PR, HER2 （P＞0.05）. Conclusion:  PTEN and PPARγ can be used as a specialty prognosis marker, it can give an evidence　for human breast cancer biotherapy and clinic prognosis.

　　Key words:  breast cancer;  gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten (PTEN);  peroxisome  proliferators activated receptor γ(PPARγ);  immunohistochemistry; molecule  pathology

　　乳腺癌(HBC)是女性常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有130万妇女患乳腺癌，50万人死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位，我国虽属乳腺癌的低发区，但近年来发病率增长趋势明显，目前国内约有47万患者，在一些城市已成为女性恶性肿瘤发病的首位，20年后，乳腺癌将是我国发病率最高的恶性肿瘤［1］。肿瘤的发生、发展与癌基因的激活与抑癌基因的失活有关，目前与张力蛋白同源的第10号染色体丢失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN）已被确定为一个抑癌基因，该基因编码的蛋白PTEN能特异性地使磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸(phosphatidylinositol 3，4，5triphosphate， PIP3)去磷酸化，拮抗磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT信号传导通路，具有调节细胞生长、增殖、迁移、分化等多种效应 ［2］。过氧化物酶体增长因子活化受体(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)最初由英国科学家Issemann和Green于1990年发现，因其可以被过氧化物酶体增殖剂激活而得名，后来被认为属于核激素受体(nuclear hormonereceptor)超家族的新成员。目前已鉴别出3种PPAR亚型，即PPARα、PPARγ和PPARδ，它们由不同的基因编码，氨基酸序列高度相似，特别是在DNA结合域和配体结合域。PPAR的生物学功能复杂，参与调节脂质代谢与糖代谢、脂肪细胞分化和能量平衡、炎症反应、动脉粥样硬化及肿瘤细胞的分化与凋亡等生理和病理过程，其中PPARγ与肿瘤的关系已日益引起人们关注［3］。PTEN单指标在乳腺癌中的表达已有报道［4,5］，但在乳腺癌组织切片中联合检测PTEN和PPARγ表达的情况报道较少见。本研究利用免疫组织化学方法检测乳腺癌中PTEN和PPARγ的表达情况，结合临床资料分析PTEN和PPARγ在乳腺癌发生、发展中的作用和可能机制，为进一步研究靶向治疗和乳腺癌分子病理学分型提供基础研究依据。

1材料与方法

　　1.1材料随机选取2004年2月～2007年1月新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科手术切除的乳腺癌存档标本66例，均为女性，年龄31～69岁，中位年龄46岁。病理证实为乳腺癌，按照NCCN制定的乳腺癌TNM分期标准：Ⅰ期2例，Ⅱa期9例，Ⅱb期21例，Ⅲa期23例，Ⅲb期9例,Ⅳ期1例，将存档标本重新包埋，4 μm连续切片，做免疫组织化学染色。

　　1.2免疫组织化学检测鼠抗人PTEN抗体、SP试剂盒、鼠抗人PPARγ单抗、雌激素受体（ER）抗体、孕激素受体（PR）抗体、Her2（北京中杉金桥生物有限公司）均为即用型产品，工作浓度1∶70。微波修复，其余步骤按链霉素抗生物素过氧化酶（SP）法进行，PTEN、PPARγ均用癌旁非癌组织做阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照,二氨基联苯胺（DBA）显色。

　　1.3阳性判断标准

　　1.3.1PTEN结果判定参照 Axiotis 等 ［6］的标准，高倍镜（×400）下， 根据染色强度和阳性细胞所占比例进行判定。染色强度评分标准：不着色 0 分，黄色1 分，棕黄色2分，黄褐色 3分。阳性细胞所占比例评定标准：阳性细胞率＜10％为0分，10％～40％为 1分，41％～70％为 2分，＞70％为 3分。两种评分相加，0～1分为阴性,≥3分为阳性。

　　1.3.2PPARγ结果判定［7］随机选取 10个不重复高倍镜视野（不足10个视野的，按实际观察到的视野数），根据阳性细胞占观察同类细胞总数的百分率分为：阴性（-）:细胞染色弱，阳性细胞率＜30％；阳性（+）:细胞比较集中，阳性细胞率为 ＞30％。

　　1.4统计学处理采用SPLM3.0统计软件对数据进行分析，定性资料根据样本理论频数采用Fisher确切概率法或χ2检验，检验水准α=0.05,指标之间的相关性采用有序表的相关分析。

　　2结果

　　2.1乳腺癌组织中PTEN及PPARγ的表达66例乳腺癌患者中PTEN表达阳性率占68.2％，PPARγ表达阳性率占63.6％。PTEN阳性乳腺癌切片表达阳性部位主要在细胞核内，占72.86%，胞浆表达占27.14％。PTEN蛋白阳性定位于癌细胞胞浆和胞核，呈棕黄色颗粒，与正常组织相比癌细胞中PTEN蛋白在胞浆中分布不均匀（图1a），阳性部位靠近胞核（图1b），在病期较晚的患者切片中PTEN胞核内表达较明显（图1c），有的甚至阴性表达（图1d）。PPARγ阳性主要定位于肿瘤细胞核膜上（图2a），呈棕黄色颗粒状，细胞质内也见PPARγ蛋白的表达（图2b），胞浆内PPARγ表达不均一，呈片状。

　　2.2乳腺癌组织中PTEN、PPARγ、ER、PR与Her2表达的相互关系有序表的相关分析表明，在乳腺癌组织中PTEN的表达与PPARγ、ER、PR、Her2的阳性表达均无显著相关（P均＞0.05），Pearson积距相关系数分别为0.035 7、0.173 2、3.029 8、0.216 1;PPARγ的表达与ER、PR、Her2阳性表达均无显著相关（P均>0.05),Pearson积距相关系数分别为0.158 4、0.132 0、0.212 5,见表1。

　　图1PTEN在乳腺癌组织中的表达（×400)（略）

　　a: 胞浆；　b:　胞浆和核膜；　c:　胞核；　d:　阴性表达

　　图2PPARγ在乳腺癌组织中的表达（×400）（略）

　　a: 核膜；　b: 胞浆2.3PTEN、PPARγ、ER、PR与Her2在乳腺癌组织中的表达与淋巴结转移的关系PTEN表达阳性、阴性乳腺癌患者淋巴结转移率分别为48.97％、46.04％，PPARγ表达阳性、阴性乳腺癌患者淋巴转移率分别为53.96％、43.64％，PTEN 和PPARγ阴性表达者淋巴结转移率较高，相反PTEN 和PPARγ蛋白阳性表达淋巴结转移率较低，见表2。

　　表1乳腺癌组织中PTEN、PPARγ、ER、PR与Her2表达的相互关系（略）

　　3讨论

　　目前PTEN基因被确定为一个抑癌基因，在多种肿瘤中发现有体细胞PTEN基因的缺失和突变［2］,该基因蛋白的阴性表达被认为与肿瘤的预后有关。PPAR 3种亚型的分布具有组织特异性: α主要分布在心肌、肾脏及肝脏，γ主要由脂肪细胞和免疫系统表达，而δ分布广泛［8］。PPARγ是调节脂肪细胞分化的重要转录因子［9］，亦在多种非脂肪源性肿瘤中高表达，噻唑烷二酮类药物（TDZs）可以抑制这些肿瘤的生长［10］。本研究结果表明乳腺癌组织中PTEN、PPARγ、ER、 PR 、Her2等指标间各自相互独立，无明显相关性，提示PTEN、PPARγ可能是新的乳腺癌预后的独立标记物。本研究结果与Depowski等［11］报道相近。 Shi等［12］发现36% 乳腺癌患者有PTEN蛋白表达缺失或减弱，Lin等［4］的研究结果证明了PTEN的低表达与乳腺癌患者的不良预后相关。Bose等［5］调查发现PTEN蛋白表达随乳腺癌病情进展而降低。大多数学者认为PTEN蛋白均定位于细胞质中，而最近有学者对成胶质细胞瘤与正常组织进行免疫组化染色［13］，在细胞核及核周边区域均发现有特异性蛋白表达。本研究发现在乳腺癌组织中，细胞核及其周边区域也有PTEN的特异性表达。Sano等［14］首先运用卡迈氏存活点检测发现蛋白表达高低与患者的病理分级及预后有关，预后越差，恶性程度越高，PTEN蛋白表达水平越低。Yuan［15］报道PTEN在乳腺癌组织中表达突变，发现正常乳腺组织中PTEN呈高表达，有腋淋巴结转移的乳腺癌组织中PTEN表达率为37.8%，明显低于无腋淋巴结转移者。PTEN表达水平与患者肿瘤大小、组织学分级及临床分期有关，随组织学分级和临床分期的增加，PTEN表达呈下降趋势。本研究结果也显示PTEN表达阴性的乳腺癌患者淋巴结转移率明显高于PTEN蛋白表达阳性的患者。此外，本研究还发现在乳腺癌患者切片中多数患者PTEN蛋白阳性表达，但表达部位与正常乳腺组织相比较偏向于细胞核周围和核内表达，正常乳腺组织PTEN主要表达在胞浆且表达较为均匀。由此推断PTEN在乳腺癌患者中虽然表达但可能不能发挥应有的生理作用，或者有无功能的融合蛋白的表达。因此对PTEN活性分子构象还有待进一步的研究。PPARγ正常表达位置在核膜，本研究发现乳腺癌组织中PPARγ表达也较丰富，提示PPARγ的配体在PPARγ表达阳性的乳腺癌患者中可以发挥其诱导细胞分化、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制血管生成和降低肿瘤细胞的侵袭能力等方面的作用。

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