缺氧诱导因子1α及其靶基因在子痫前期患者胎盘组织中表达的意义

作者:尹政,侯丽丽,华政哲,杨秋 作者单位：沈阳医学院2002级临床医学英文一班,辽宁沈阳110034

        【摘要】  研究缺氧诱导因子1α (HIF1α)及其靶基因血管内皮细胞生长因子(VEGF)在子痫前期患者胎盘组织中的表达和相关性，探讨HIF1α、VEGF在子痫前期发病机制中的作用。方法：采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白过氧化酶连接法（SP）法对20例子痫前期患者（子痫前期组）和15例正常妊娠妇女（对照组）胎盘组织中HIF1α、VEGF蛋白表达进行半定量分析；应用RTPCR技术检测两组胎盘组织中HIF1α、VEGFmRNA的水平并进行相关性分析。结果：（1）免疫组化结果显示，子痫前期组HIF1α蛋白表达明显增强，其中（+++）阳性表达率分别为45%，显著高于对照组13.3%（P<0.05），而VEGF蛋白表达明显减弱，其中（+++）阳性表达率为15%,显著低于对照组（P<0.01）。（2）子痫前期组HIF1α mRNA的水平为(0.604±0.013)，显著高于对照组的（0.208±0.007），两组比较，差异有统计学意义（P<0.05），VEGF mRNA表达水平虽有升高，但与对照组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：HIF1α在子痫前期胎盘组织中的表达明显升高，可能通过调节靶基因VEGF的转录影响滋养细胞的浸润功能和胎盘血管重铸，在子痫前期的发病过程中发挥重要作用。

【关键词】  妊娠并发症；缺氧诱导因子1α;血管内皮细胞生长因子;受体

　　Study on the Expressionof Hypoxiainducible Factor1α，VEGFand sFlt1 in Preeclamptic Placenta

　　ＹＩＮ　Ｚｈｅｎｇ，ＨＯＵ　Ｌｉｌｉ，ＨＵＡ　Ｚｈｅｎｇｚｈｅ，ＹＡＮＧ　Ｑｉｕｓｈｉ，ＤＯＮＧ　Ｌｉｎ，ＳＵＮ　Ｓｈｕｇｕａｎｇ

　　(１．Ｃｌａｓｓ　Ｏｎｅ　Ｇｒａｄｅ　２００２　ｏｆ　Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１００３４，Ｃｈｉｎａ；２．Department of Obstetric and Gynecology,Shenzhou Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110002, Ｃhina)

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ0bjective： To investigate the expression and correlation of HIF1α and VEGF in the preeclamptic placenta, aiming to discuss the significance in the pathogenesis of preeclampsia．Methods：Ｐlacenta were collected from 20 pregnant women with preeclampsia as study group and 15 normal pregnant women as control group, the expression of HIF1α and VEGF protein were semiquantitatively analyzed with immunohistochemicall assay and mRNA level was determined by using reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) technique．Results：（1）Ｔhe expression of HIF1α protein in preeclamptic group obviously increased, with（+++）positive expression rate significantly higher than control group（P<0.05），but VEGF expression obviously reduced in preeclamptic group（P<0.01）.（2）The level of HIF1α mRNA in preeclamptic placenta was significantly higher than normal placenta（P<0.05），although the level of VEGF mRNA increased in preeclamptic placenta, but not significantly different from normal placenta（P>0.05）．Conclusion：The abnormal higher HIF1α expression in preeclamptic placenta indicated that HIF1α might play an important role in the pathogenesis of preeclampsia, possibly through affecting the cytotrophblastic invasion and placental vascular reconstruction via the modulation of VEGF gene transcription.

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓpreeclampsia；HIF1α；vascular endothelial growth factor；receptor

    妊娠高血压综合征子痫前期(以下简称子痫前期)是妊娠期特有疾病，严重危及母婴健康和生命安全。其发病机理是病理产科研究的热点问题，目前较公认的学说之一是，滋养细胞分化和功能异常导致子宫螺旋动脉生理重铸过程障碍，引起胎盘绒毛浅着床及胎盘缺血缺氧。胎盘氧含量对滋养层相关的生理和病理有重要的调节作用。研究发现作为激活缺氧反应基因转录的调节因子，缺氧诱导因子1α (HIF1α)在低氧条件下可通过调节靶基因血管内皮细胞生长因子(VEGF)的转录，参与多种与血管形成有关的疾病。本研究采用免疫组化法和RTPCR技术分别检测子痫前期和正常胎盘组织中HIF1α、VEGF蛋白和mRNA表达的差异和相关性，初步探讨HIF1α及其靶基因在子痫前期发病机制中的作用。

　　１  资料与方法

　　１.１  研究对象

　　选择2007年5月至2007年7月在沈洲医院妇产科住院选择剖宫产结束妊娠者35例，其中子痫前期20例，孕妇年龄24～34岁，平均 (26.9±1.9)岁，平均孕周（36±2）周;子痫前期的诊断标准参照《妇产科学》（第6版）［1］。正常孕妇15例，年龄25～33岁，平均(27.3±1.4)岁，平均孕周（38±2）周。入选病例均无原发性高血压、心脏病、糖尿病、肾病、贫血及前置胎盘等、近期无急、慢性感染。两组孕妇年龄及孕周差异均无统计学意义（P>0.05）。

　　１.２  方法

　　1.2.1  标本采集

　　胎盘娩出后立即切取近脐带附着处全层胎盘组织两块，每块1 cm×1 cm×1 cm，用灭菌生理盐水反复漂洗后分成两份，一份置入4%中性多聚甲醛固定,用于免疫组化测定；另一份用无菌纱布吸去水分，装入RNA酶灭活的冻存管，迅速投入液氮中，整个操作在5 min内完成，过夜后转入－80℃冰箱保存用于RNA的提取及RTPCR技术检测。

　　1.2.2  免疫组化法检测胎盘组织中HIF1α、VEGF蛋白的表达

　　固定标本常规脱水，石蜡包埋并制成3cm厚度连续切片，经HE染色判断切片质量后，采用链霉素抗生物素蛋白－过氧化酶（SP）连接法在同一时间，同一条件下进行免疫组化检测。鼠抗人HIF1α单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体均为美国Novus公司产品。染色步骤参照SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司提供）说明书进行，微波修复抗原，一抗滴度均为1：100。 磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。每张切片观察l0个高倍视野，根据阳性细胞比例及着色深浅计分，细胞无着色或无阳性细胞为0分；细胞染色为浅棕色或阳性细胞1%～25%为1分；细胞染色为棕褐色或阳性细胞26%～49%为2分；细胞染色为深棕色或阳性细胞>50%为3分。根据计分结果判断阳性等级：0～1分为（－）； 2分为（+）；3～4分为（++）；5～6分为（+++）。

　　1.2.3  RTPCR技术检测胎盘组织中HIF1α、VEGFmRNA的表达  RTPCR扩增引物根据Genebank提供的资料设计，HIF1α、VEGF引物序列见表1。引物及试剂盒由大连宝生生物公司提供。采用Trizol一步法提取胎盘组织总RNA。反应总体积20μｌ, RNA模板量1μg，参照试剂盒说明进行逆转录酶反转录。PCR反应条件：94℃预变性5min、94℃变性 40s、，52℃退火1 min，72℃延伸1min，在PCR扩增仪上（美国Perkin Elmer公司产品）共完成32个循环。取5μｌ PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，β肌动蛋白作为内参照，紫外透射成像系统显像，测定特异条带的密度并与内参照比较，得出目的基因片段的相对表达量。表1  HIF1α、VEGF及βactin引物序列（略）

　　1.3  统计学方法

　　采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。所测数据以ｘ±s表示，组间比较采用t检验和χ2检验，相关资料采用Spearman等级相关分析。

2  结果

　　2.1  两组孕妇胎盘组织中HIF1α、VEGF蛋白表达的比较

　　组孕妇胎盘组织中，HIF1α蛋白主要表达在合体滋养细胞和细胞滋养细胞的细胞核中，间质细胞少见。子痫前期胎盘组织中阳性表达明显增强，棕黄色阳性颗粒主要分布在合体滋养细胞中，强阳性表达率为 45%,明显高于对照组的13.3%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

　　VEGF在两组孕妇胎盘组织中的分布基本一致，主要分布在细胞滋养细胞，血管内皮细胞及绒毛间质细胞，在子痫前期组胎盘中VEGF的阳性表达明显减轻，其中10例染色强度为（+），7例（++），3例（+++）；与对照组相比较，子痫前期组VEGF（+++）阳性表达率为15%,明显低于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.01), 见表2。表2  两组孕妇胎盘组织中HIF1α及VEGF蛋白阳性表达水平的比较（略）注：与对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

　　2.2  两组孕妇胎盘组织中HIF1α、VEGFmRNA表达水平的比较

　　琼脂糖凝胶电泳扩增结果显示，子痫前期胎盘组织中HIF1α表达水平分别（0.604±0.013）明显高于对照组的（0.208±0.007），两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；尽管子痫前期胎盘组织中VEGF mRNA表达水平有所提高，但与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05);两组HIF1α、VEGFmRNA表达的图像分析结果见表3,琼脂糖凝胶电泳扩增结果见图1。表3两组孕妇胎盘组织中HIF1α、VEGFmRNA表达水平的比较（略）注：与对照组比较，11P<0.05

　　3  讨论

　　3.1  HIF1α在胎盘组织中的表达及意义

　　HIF1属于bHLHPAS蛋白家族，由α和β两个亚基组成的异二聚体。缺氧条件下HIF1α和细胞核内稳定存在的HIFβ亚基结合形成有活性的二聚体，从而调控缺氧反应基因的表达。目前已经证实由HIF1α介导转录的基因有：VEGF及其受体sFlt1、细胞生成素、内皮素1、Bcl2及糖酵解有关的酶基因等[2]。这些靶基因的产物参与血管的发生及功能调节、细胞能量代谢和细胞凋亡的病理生理过程，是机体对缺氧产生耐受和适应的重要调节机制,HIF1α则是缺氧调节通路上的关键环节之一。

　　在胎盘形成过程中，滋养细胞的侵润能力决定妊娠的结局，而滋养细胞的侵润和胎盘局部氧含量密切相关，低氧可以促进滋养细胞的增殖和分化却抑制滋养细胞对子宫内膜的侵润。随着绒毛间隙血流的增加，滋养细胞的侵润能力在孕10～12周左右达高峰，然后下降。有研究表明作为氧敏感调控因子，HIF1α在妊娠早期绒毛组织中的表达与TGFβ3的表达同步，妊娠5-8周表达增高，并于妊娠10～12周胎盘氧含量上升时下降，同时证明低氧分压条件下培养绒毛组织并用反义核酸抑制HIF1α，可以抑制TGFβ3mRNA的表达，故推测缺氧可通过HIF1α下调TGFβ3的表达，从而促进早期滋养细胞向侵袭型分化，有利于胎盘血管重铸[3]。本研究发现在子痫前期胎盘组织中，HIF1α的蛋白表达明显增强，其中强阳性表达率显著高于对照组，同时HIF1αmRNA水平也明显升高，说明HIF1α从mRNA和蛋白两个水平参与子痫前期的病理生理过程。

　　3.2  胎盘组织中VEGF表达的意义

　　VEGF是一种高效特异的内皮细胞有丝分裂原，与其受体sFlt1结合发挥强烈的促血管生长及增加微血管通透性的作用。研究表明VEGF及其受体在早孕期主要表达于细胞滋养细胞，而在中、晚孕期主要位于合体滋养细胞，并且滋养细胞源性VEGF可通过旁分泌调节滋养细胞的分化和代谢[4]。作为重要的血管诱生因子，VEGF在妊娠早期参与胎盘血管网的形成，而在妊娠晚期主要调节血管内皮细胞的通透性，有利于胎儿生长发育。然而关于VEGF在子痫前期胎盘组织中表达的研究结论不一，Chun［5］等研究发现子痫前期胎盘组织中VEGF表达升高同时伴有VEGF受体表达升高，VEGF受体通过抑制VEGF介导的滋养细胞和血管内皮细胞功能调节，导致子痫前期的发生。本研究结果显示，在子痫前期胎盘组织中，VEGF蛋白表达明显降低, mRNA表达水平虽有升高，但与对照组比较，差异无显著性。随着对VEGF研究的深入，目前至少已发现4种VEGF分子亚型，它们在生物学和结构特性上有所不同[6,7]，以往研究应用抗体的不同可能是导致这种差异表达的原因，说明对VEGF亚型在子痫前期发病机制中的作用还需深入研究。

3.3  胎盘组织中HIF1α、VEGF表达的相关性及意义

　　作为HIF1α转录调节的一个靶基因，VEGFmRNA在子痫前期胎盘组织中表达虽有升高但不显著，VEGF蛋白表达明显降低，推测是子痫前期细胞滋养细胞功能缺陷的结果，即缺氧激活HIF1α的表达并诱导下游VEGF基因的转录，表现为VEGFmRNA代偿性升高，但由于滋养细胞功能受损VEGFmRNA升高并不明显，并且蛋白表达显著降低，从而影响导致胎盘血管构建障碍及血管内皮细胞通透性的改变，加重子痫前期的病理变化。

　　目前认为子痫前期的发生是滋养细胞侵润功能障碍导致胎盘血管重铸不良的结果，而滋养细胞侵润受胎盘局部氧含量的精细调控。本研究结果提示，作为缺氧敏感调节因子的HIF1α在子痫前期胎盘组织中蛋白和mRNA表达均增高，可能通过调节下游基因VEGF的转录影响滋养细胞的侵润功能，参与子痫前期的发生发展。因此关于胎盘滋养细胞中HIF1α在低氧应激中的转录调节活性,以及对下游基因VEGF表达调控的确切机制有待深入研究,为探讨子痫前期的发病机理提供理论基础。

【参考文献】  　　［１］乐杰.妇产科学［Ｍ］.第6版.北京人民卫生出版社, 2004, 99-100

　　［2］Kallio PJ, Wilson WJ, O'Brien S,et al. Regulation of the hypoxiainducible transcription factor 1alpha by the ubiquitinproteasome pathway ［Ｊ］.Biol Chem, 1999,274:6519-6525.

　　［3］Scheid A, Spielmann P, et al Oxygenregulated expression of TGFbeta 3, a growth factor involved in trophoblast differentiation ［Ｊ］. Placenta, 2003, 24:941-950．

　　［4］Shore L,Wang TH,Wang CL,et al. vascular endothelium growth factor, placenta growth factor and their receptors in isolatedhuman trophoblasts ［Ｊ］. Placenta, 1997,18；651-665.

　　［5］Chun JY, Song Y, et al. Differential expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), endocrine gland derivedVEGF, and VEGF receptors in human placentas from normal and preeclamptic pregnancies ［Ｊ］.J Clin Endocrinol Metab, 2004 89:2484-2490．

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　　［7］ Nagamasu T,Fujii T, Kusumi M,et al.Cytotrophoblasts upregulate soluble fmslike tyrosine kinase1 expression under reduced oxygen: an implication for the placental vascular development and the pathophysiology of preeclampsia ［Ｊ］.Endocrinology, 2004,145:4835-4837.