Epo及其受体在宫颈癌及癌前病变组织的表达

作者:王崇娟,崔竹梅  作者单位：青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003

   【摘要】  目的 了解促红细胞生成素（Epo）及其受体(EpoR)在宫颈癌及其癌前病变组织的表达及其意义。方法 用半定量RTPCR法，检测30例宫颈癌组织Epo、EpoR mRNA含量，用免疫组化PV6000方法检测50例宫颈癌及其癌前病变组织Epo、EpoR蛋白表达，并与正常宫颈组织比较。结果 Epo、EpoR mRNA在宫颈癌及正常宫颈组织中均有表达，在宫颈癌组织中的表达水平较高，各组间比较差异有显著性（F=11.83、173.73,q=4.83、10.86,P<0.05）。Epo、EpoR蛋白表达均为阳性，各组间表达率比较，差异有显著性（χ2=5.78、15.88,P<0.05），Epo、EpoR蛋白表达率随宫颈病变程度的加重明显增加；EpoR蛋白表达与Epo蛋白表达呈显著正相关（r=0.57,P<0.01）。结论 Epo/EpoR的表达可能与宫颈癌发生发展有关。

【关键词】  促红细胞生成素 受体 宫颈上皮内瘤样病变 宫颈癌

    EXPRESSIONS OF ERYTHROPOIETIN AND ERYTHROPOIETIN RECEPTOR IN CERVICAL CANCER AND PRECANCEROUS  LESIONWANG CHONGJUAN, CUI ZHUMEI, SUN XIANLU, et al(Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao  266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expressions of erythropoietin (Epo) and erythropoietin receptor (EpoR) in cervical cancer and precancerous lesion. MethodsEpo and EpoR mRNA in 30 cases of cervical cancer were determined by semiquantitative RTPCR, and the protein expressions of Epo and EpoR in 50 cases of cervical cancer and precancerous lesion were analyzed by immunohistochemistry PV6000.ResultsmRNA expressions of Epo and EpoR were found in both cervical cancer and normal cervix，with the expressions in cervical cancer significantly higher. The differences in Epo and EpoR mRNA expressions among different cervical cancer groups were significant (F=11. 83,173.73;q=4.83,10.86;P<0.05). Positive staining of Epo and EpoR protein was found in all groups, the differences among different groups were significant (χ2=5.78,15.88;P<0.05). The Epo and EpoR increased along with the severity of the lesions. The EpoR expression was higher than Epo in the other groups. There was a positive correlation betweem Epo and EpoR (r=0.57,P<0.01). ConclusionEpo and EpoR may play an important role in the development of cervical cancer.

    ［KEY WORDS］erythropoietin； receptor； cervical intraepithelial neoplasia； cervical carcinoma

    最近研究发现，促红细胞生成素（Epo）不仅能促进红系祖细胞增生分化，而且还通过结合促红细胞生成素受体（EpoR），激活Epo/EpoR信号转导途径，参与肿瘤细胞抗凋亡、抗低氧及肿瘤新生血管生成。有关Epo/EpoR与肿瘤的关系，在多种肿瘤中已有研究，如肺癌、乳癌、头颈部癌及卵巢癌等。本实验旨在探讨Epo/EpoR在宫颈癌发生发展过程中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  材料来源  新鲜组织标本：包括30例宫颈癌和10例正常宫颈组织。宫颈癌组织取自2005年4月～2006年5月青岛大学医学院附属医院手术病人，年龄28～49岁，平均（39.43±5.75）岁；病理分级：G16例，G216例，G38例；FIGO分期：ⅠB期18例，Ⅱ期12例；病理类型：30例均为鳞状细胞癌。正常宫颈取自因子宫肌瘤行子宫全切的病人，病人年龄45～49岁，平均（47.00±1.25）岁。所有标本均放在-70℃冰箱中保存备用。

石蜡标本：取自青岛大学医学院附属医院病理科2004～2006年存档蜡块，包括50例宫颈病变及15例正常宫颈，病人年龄27～61岁，平均（41.86±6.97）岁。宫颈病变组织来自活检或手术病人，包括CINⅠ12例，CINⅡ5例，CINⅢ 7例，原位癌14例（9例累及腺体），宫颈癌12例（6例中分化鳞癌，2例伴早期浸润，1例淋巴结转移；2例低分化鳞癌，1例淋巴结转移；2例高分化鳞癌；1例中分化浆液性腺癌；1例宫颈黏液表皮样癌伴有淋巴结转移）。正常宫颈来自子宫肌瘤切除者。所有病理结果均由同一病理医师诊断。

    1.1.2  主要试剂  Trizole液(Sangon公司)，逆转录试剂盒（美国Promega公司）；一抗：兔抗人Epo多克隆抗体（H162:sc7956,SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC）、兔抗人EpoR多克隆抗体（H194:sc5624,SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC）；PV6000试剂盒（北京中杉公司）。

    1.2  Epo、EpoR mRNA检测

    1.2.1  引物设计与合成  根据Primer 5.0软件设计Epo、EpoR及GAPDH引物，经BLAST分析，确定其特异性。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表1。 表1  Epo、EpoR、GAPDH引物序列名称引物序列扩增片段Epo上游引物

    1.2.2  RTPCR检测  Trizole液提取总RNA，紫外分光光度计（A260/A280）检测RNA纯度，逆转录反应按操作说明书进行。逆转录合成的cDNA在-20 ℃保存用于PCR。PCR反应条件：Epo 及EpoR均为 94 ℃预变性3 min；94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、1 min,共40个循环；72 ℃延伸10 min；内参照为GAPDH，94 ℃预变性3 min；94 ℃、30 s,56 ℃、30 s, 72 ℃、1 min,共28个循环；最后72 ℃延伸10 min。以去离子水代替cDNA作为空白对照。PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，采用自动电泳凝胶成像分析仪及分子分析软件进行图像扫描和分析。用Epo(或EpoR)积分灰度值/GAPDH积分灰度值作为Epo、EpoR mRNA的相对表达含量。

    1.3  Epo、EpoR蛋白检测

    采用免疫组化方法，按照PV6000试剂盒说明书进行操作，一抗工作浓度：Epo为1∶50，EpoR为1∶50，PBS替代一抗作为阴性对照。结果判断：Epo、EpoR阳性染色主要位于细胞膜、细胞质。根据阳性细胞数及染色强度进行评分，阳性细胞数评分：显微镜下（200倍）连续观察5个高倍视野，阴性计为0分，1%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，76%～100%计为4分；染色强度评分：无色（-）为0分，淡黄色（+）为1分，棕黄色（）为2分，棕褐色（）为3分。阳性细胞数评分与染色强度评分相加，<2分计为“-”，2～3分为“+”，4～5分为“”，6～7分为“”, 6～7分计为“强阳性”。

    1.4  统计学分析

    采用SPSS 11.5软件包处理数据，计量资料比较用单因素方差分析,计数资料比较用χ2检验。

    2  结    果

    2.1  RTPCR检测

    Epo、EpoR mRNA在正常宫颈及宫颈癌组织中均有表达（图1、2），在宫颈癌组织的表达较高，且随宫颈癌分期的升高而增加，差异有显著意义（F=11.83、173.73,q=4.83、10.86,P<0.05）。见表2。相关性分析显示，Epo、EpoR mRNA在各组织中的表达呈正相关（r=0.57,P<0.01）。表2  Epo及EpoR mRNA在各组中的表达比较（

    2.2  免疫组化检测

    Epo蛋白与EpoR蛋白主要表达在细胞膜、细胞质，正常宫颈组织中Epo蛋白表达的阳性率为13.33%，EpoR蛋白表达阳性率为20.00%，在宫颈病变组织中随着宫颈病变程度的加重，Epo蛋白与EpoR蛋白表达强度增加，分布密度增加，差异有显著性（χ2=5.78、15.88,P<0.05）。见表3。表3  不同宫颈组织中Epo与EpoR蛋白的表达

3  讨    论

    Epo是一种糖蛋白细胞因子，相对分子质量为34 000,与EpoR结合后，形成同源二聚体，再通过JAK/STAT和Ras/MAP激酶等信号转导途径调节红系的增生和分化。EpoR是造血细胞因子受体超家族中的一员，近年来研究发现，EpoR不仅存在于红系干细胞，多种肿瘤细胞中也可表达EpoR，Epo/EpoR的非造血作用已成为研究的热点。YOSHIKO等[1]对24种人类恶性细胞系中Epo/EpoR的作用研究显示，Epo信号转导途径参与肿瘤生长及血管生成，对几乎所有恶性肿瘤的发展都起作用。刘志忠等[2]用免疫组化方法研究Epo在脑胶质瘤中的表达及其与肿瘤病理分级、Ki67、CD105的关系，发现Epo的表达可作为判断脑胶质瘤恶性程度的一个重要指标，Epo能促进肿瘤细胞增殖和血管形成，从而促进肿瘤生长。类似的研究在头颈部鳞癌[3,4]、肺癌[5]、前列腺癌[6]、卵巢癌[7]等肿瘤中均有报道。提示Epo/EpoR信号途径可能与肿瘤细胞的抗凋亡、抗低氧及侵袭转移有关。

    本实验探讨了Epo、EpoR在宫颈病变中的表达情况，结果显示，Epo、EpoR mRNA在正常宫颈及宫颈癌组织中均有表达，且随着宫颈病变程度的加重，其表达量相应增加，其中，EpoR mRNA增加程度较明显，二者在各组织中的表达呈显著相关性。免疫组化分析显示，Epo蛋白在正常宫颈组织中的阳性表达率较低，仅为13.33%，而在轻中度不典型增生中阳性表达率为58.52%，在重度不典型增生及以上病变中阳性表达率为100.00%；EpoR蛋白的表达趋势与Epo蛋白相一致，但在各组织中的阳性、强阳性表达率比Epo稍高，其原因不清。研究已证实，低氧是Epo产生的主要和直接刺激因子。GEZA等[8]研究表明, EpoR在宫颈不典型增生及宫颈癌组织中表达升高，低氧可进一步诱导EpoR的升高。 本实验中EpoR表达较高，是否与EpoR比Epo对低氧更敏感有关，需进一步研究。

    本文研究结果显示，中、低分化的宫颈鳞状细胞癌中Epo、EpoR的表达比高分化鳞癌高，推测Epo、EpoR的表达与宫颈癌细胞的分化程度有关。免疫组化研究显示，有早期浸润及远处转移病人的Epo、EpoR蛋白表达增加更明显，并且Epo、EpoR蛋白不仅在宫颈癌细胞中高表达，在血管内皮细胞中也有表达，推测Epo、EpoR可能参与了宫颈癌新生血管生成。新生血管生成是宫颈癌生长、转移的必要条件，JAQUET等[9]研究认为，Epo可能是一种新的促血管生长因子，RIBATTI等[10]研究结果表明，EpoR与肿瘤新生血管生成程度有相关性。本实验中有2例特殊类型的宫颈癌（中分化浆液性腺癌和宫颈黏液表皮样癌），其Epo、EpoR蛋白表达比周围正常组织明显增高，提示Epo、EpoR的表达可能与宫颈癌组织来源无明显关系。

    已有研究证实，宫颈癌及人类其他恶性肿瘤中存在Epo及EpoR的高表达，Epo、EpoR在肿瘤中的作用也渐清晰，主要集中在肿瘤细胞抗凋亡、抗低氧及促进肿瘤新生血管生成方面。鉴于Epo、EpoR与肿瘤关系密切，因此，应用重组人促红细胞生成素rhEPO治疗肿瘤相关性贫血应慎重考虑。肿瘤病人贫血发生率较高，大约50%肿瘤病人发生贫血，而在晚期肿瘤或接受化疗或放疗的病人中，贫血的发生率则高达90%。自从rhEPO广泛应用于肾性贫血的治疗以来，rhEPO治疗贫血取得了肯定的疗效。应用rhEPO治疗肿瘤相关性贫血也逐渐增多。但研究发现，rhEPO虽可一定程度改善贫血症状，但不利于肿瘤的控制及预后，可增强肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性。另有大量研究显示，外源性或内源性Epo均能促进肿瘤的生长。但个别研究发现，Epo治疗贫血不影响肿瘤的生长。陈卫东等[11]研究rhEPO对贫血荷瘤小鼠的放射效应，结果显示rhEPO对贫血荷瘤小鼠的放射有增敏效应。因此，Epo与肿瘤性贫血治疗关系需进一步研究。

总之，Epo、EpoR在人类多种肿瘤细胞中高表达，且大多数研究表明Epo、EpoR的高表达参与了肿瘤血管生成，促进肿瘤生长、转移，影响肿瘤病人的预后。Epo、EpoR信号转导在多种肿瘤的发生发展过程中起作用，因此阻断该传导途径中的某一环节，可抑制肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤的发生发展。关于Epo、EpoR与肿瘤的关系需要进一步的研究，能否用重组的Epo治疗肿瘤相关性贫血还有待于探索。

【参考文献】  [1]YOSHIKO Y, YOSHIHIKO F, TAKUYA M, et al. Erythropoietin regulates tumour growth of human malignancies[J]. Carcinogenesis, 2003,24(6):10211029.

[2]刘志忠，张宇新，丁秀荣，等. 脑胶质瘤促红细胞生成素的表达及其生物学意义[J]. 实用肿瘤杂志, 2005,20(1):4345.

[3]MOHYELDIN A, LU H, DALGARD C, et al. Erythropoietin signaling promotes invasiveness of human head and neck squamous cell carcinoma[J]. Neoplasia, 2005,7(5):537543.

[4]LAI S Y, CHILDS E E, XI S, et al. Erythropoietinmediated activation of JAKSTAT signaling contributes to cellular invasion in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Oncogene, 2005,24(27):44424449.

[5]KOAMI D, EMILIE P, FREDERIC C, et al. Expression of erythropoietin and erythropoietin receptor in nonsmall cell lung carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2005,11:993999.

[6]FELDMAN L, WANG Y, RHIM J S, et al. Erythropoietin stimulates growth and STAT5 phosphorylation in human prostate epithelial and prostate cancer cells[J]. Prostate, 2006,66(2):135145.

[7]MCBROOM J W, ACS G, ROSE G S, et al. Erythropoietin receptor function and expression in epithelial ovarian carcinoma[J]. Gynecol Oncol, 2005,99(3):571577.

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[9]JAQUET K, KRAUSE K, TAWAKOL K M. Erythropoietin and VEGF exhibit equal angiogenic potential[J]. Microvasc Res, 2002,64(2):326333.

[10]RIBATTI D, MARZULLO A, NICO B, et al. Erythropoietin as an angiogenic factor in gastric carcinoma[J]. Histopathology, 2003,42(3):246250.

[11]陈卫东，张归琦，安永恒. rhEPO结合高低氧对贫血荷瘤小鼠放射增敏的效应[J]. 齐鲁医学杂志， 2002,17(4):286289.