P-糖蛋白、Survivin蛋白在卵巢上皮性癌中的表达及其与卵巢癌耐药的关系

作者:高庆,邢兰英,王咏雪

作者单位：西安交通大学第二附属医学院妇产科，陕西西安 710004

    【摘要】  　　目的 检测抑凋亡蛋白Survivin及多药耐药基因mdr1的表达蛋白P糖蛋白(Pgp)在卵巢上皮性癌中的表达，分析其在卵巢癌化学治疗耐药中的作用及与临床病理学特征间的关系。方法 应用免疫组织化学技术SP法检测8例正常卵巢组织、16例良性上皮性卵巢肿瘤、46例上皮性卵巢癌(浆液性癌28例、粘液性癌12例、内膜样癌6例)组织中的Survivin、Pgp蛋白的表达情况。结果 Survivin、Pgp蛋白在卵巢癌组织中阳性表达率分别为60.9%和34.8%，显著高于良性上皮性卵巢肿瘤组织31.3%、0%和正常卵巢组织(阴性)(P<0.05)。Survivin蛋白在Ⅲ-Ⅳ期恶性上皮性卵巢肿瘤组中的阳性表达高于Ⅰ-Ⅱ期肿瘤组(P<0.05)；在低分化恶性上皮性卵巢肿瘤组织中的阳性表达高于中、高分化肿瘤组，有显著性差异(P<0.05)，但与肿瘤组织类型无关。Survivin与Pgp在恶性上皮性卵巢肿瘤组中存在共同表达，卡方检验P<0.05，呈正性相关。结论 卵巢癌存在原发性耐药，而由Survivin高表达引起的凋亡抑制在卵巢癌多药耐药的发生中起一定作用。

【关键词】  卵巢肿瘤；多药耐药；P-糖蛋白；Survivin蛋白；免疫组织化学

　　The expression of survivin and Pgp proteins　in epithelial ovarian carcinoma and its relationship with　multidrug resistance in ovarian carcinoma

　　Gao Qing, Xing Lanying, Wang Yongxue

　　(Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of  Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective  To detect the expression of inhibitor of apoptosis protein survivin and mdr1 gene protein Pgp in ovarian epithelial carcinoma, and analyze their functions of drug resistance in chemotherapy and the relationship with pathological characteristics. Methods  We detected the expression of survivin and mdr1 proteins in 8 cases of normal ovarian tissues, 16 cases of benign epithelial ovarian tumor tissues and 46 cases of epithelial ovarian cancerous tissues (28 cases of serous cystadenocarcinoma, 12 cases of mucinous cystadenocarcinoma, and 6 cases of endometrioid carcinoma) with immunohistochemistry. Results  The positive rate of survivin and mdr1 proteins in ovarian cancerous tissues was 60.9% and 34.8%, respectively, which was significantly higher than that in benign epithelial ovarian tumor tissues (31.3% and 0%) and normal ovarian tissues (negative) (P<0.05).In epithelial ovarian carcinoma group, the level of survivin expression in stage Ⅲ-Ⅳ was significantly higher than that in stage Ⅰ～Ⅱ, and the positive rate in low differential epithelial ovarian carcinoma tissues was higher than in medium and high differential epithelial ovarian carcinoma tissues (P<0.05). There was no significant difference among different pathological types. There was coexpression of survivin and mdr1 in ovarian epithelial carcinoma, and positive correlation was seen for survivin and mdr1 in chisquare test. Conclusion  Primary drug resistance exists in ovarian carcinoma. The abnormal survivin gene expression in ovarian cancerous tissues might induce apoptosis suppression, which might play a role in primary drug resistance and multiple drug resistance in ovarian carcinoma chemotherapy.

KEY WORDS: ovarian neoplasm; multidrug resistance; Pgp; survivin; immunohistochemistry

　　卵巢癌化学多药耐药(multidrug resistance, MDR)的研究既是热点问题，又是难点问题。目前认为多药耐药基因mdrl的表达产物P糖蛋白(Pgp)高表达是产生MDR的主要原因，Pgp是化疗耐药的最有力的指标，可用于预测肿瘤患者耐药[1]。而最新研究发现肿瘤细胞对凋亡的敏感性也是影响化疗效果的关键因素，本文旨在研究产生耐药的这两种不同机理之间内在联系，为探明肿瘤细胞多药耐药的详尽机制提供一些实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料来源及分组  选取本院1999年1月至2004年8月送检的卵巢癌手术标本存档蜡块46例，组织学类型：浆液性囊腺癌27例，黏液性囊腺癌13例，子宫内膜样癌6例；病理分化程度：中、高分化组22例，低分化组24例；临床分期[按国际妇产科联盟(FIGO)标准，1986年]：Ⅰ、Ⅱ期10例，Ⅲ、Ⅳ期36例。标本经病理诊断证实。正常卵巢组织8例(因妇科良性疾病在本院手术切除)，卵巢良性上皮性肿瘤16例(浆液性囊腺瘤9例，黏液性囊腺瘤5例，子宫内膜样肿瘤2例)。所有患者年龄为28-74岁，平均年龄52.4岁。患者均为初次手术，术前未接受任何治疗，无乳腺癌、子宫内膜癌及胃肠道肿瘤，无卵巢恶性肿瘤家族史。三组病例患者的年龄、身高、体重、职业、有无吸烟、孕次、产次及发病时间均无显著差异。

　　1.2  试剂  鼠抗人Pgp单克隆抗体JSB1及鼠抗人SurvivinAb2多克隆抗体SC10811均购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.3  方法  采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连接(SP)法免疫组织化学检测。标本经甲醛固定，石蜡包埋，5μm连续切片。将切片常规脱蜡，浸入pH为6.0浓度为0.01mol/L枸橼酸缓冲液，微波修复抗原后入蒸馏水新鲜配制的3%(体积分数)H2O2，室温孵育10min，灭活内源性过氧化物酶，滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min。分别滴加鼠抗人Pgp单克隆抗体或鼠抗人SurvivinAb2多克隆抗体(鼠IgG1)，浓度均为1∶50，4℃过夜。37℃孵育1h。滴加生物素标记的羊抗兔IgG，37℃孵育45min。滴加生物素化辣根过氧化物酶标记链霉素，37℃孵育30min。二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，树胶封片。阳性对照用已知阳性染色乳腺癌切片，阴性对照用磷酸盐缓冲液代替一抗。

　　1.4  统计学方法  实验数据采用SPSS10.0医学统计软件(西安交通大学医学院统计教研室)进行列表卡方、Fisher确切概率法以及CC(contingency coefficient)计算列系数、KAPPA法描述相关性，以P<0.05为显著差异水平。

　　2  结果

　　2.1  结果判定  随机选择高倍镜(×40)10个视野，观察阳性表达。Pgp阳性为细胞膜上棕黄色染色；Survivin阳性为胞浆中淡黄色至棕黄色。阳性数<30%或仅少数细胞呈黄至棕色染色者定为弱阳性(+)；>70%细胞呈黄至棕色染色者定为强阳性()；介于之间者为中度阳性()；染色强度与背景无明显差别者为阴性。

　　2.2  免疫组化染色结果  Pgp蛋白及Survivin蛋白阳性表达的染色部位主要分别位于肿瘤细胞膜及胞浆，均为棕黄色颗粒状。图1(AF)均为弥漫性或局灶性分布。

　　2.3  Pgp、Survivin蛋白在正常、良性及恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达比较  Pgp在正常卵巢和良性肿瘤组织中均为阴性，46例卵巢癌组织中阳性表达16例，阳性率、过表达率(即中度以上阳性例数占总数的百分率)高于良性组，P<0.05，皆有显著性差异(表1)。

　　表1  Pgp蛋白在不同组织中的表达（略）

　　Table 1  Expression of Pgp in different tissues

　　*P<0.05 vs. normal

Survivin蛋白在正常卵巢组织中未发现阳性表达；在16例良性上皮性卵巢肿瘤中，阳性率及过表达率与正常卵巢组相比较，Fisher确切概率法P=0.130，无显著性差异；46例卵巢上皮性癌组织中表达阳性28例，阳性率及过表达率高于良性组，P<0.05，皆有显著性差异(表2)。

　　表2  Survivin蛋白在不同组织中的表达（略）

　　Table 2   Expression of survivin in different tissues

　　△△P<0.05 vs. benign tissues; △P<0.05 vs. normal

　　图1  Survivin与Pgp在不同卵巢组织中的表达（略）

　　Fig.1 Survivin and Pgp staining in the different ovarian tissues (SP×400)

　　A, D: benign epithelial ovarian tumor; B, E: high differential epithelial ovarian carcinoma tissues; C, F: low differential epithelial ovarian carcinoma tissues

　　2.4  Pgp及Survivin在卵巢上皮性癌患者临床病理因素的相关性分析  Pgp表达与卵巢上皮性癌中各临床病理参数即手术临床分期、组织学类型、病理分级均无关，P>0.05(表3)。

　　表3  Pgp蛋白表达与卵巢上皮性癌患者各临床病理因素的关系（略）

　　Table 3  Association between clinicopathologic variables and Pgp expression

　　△P<0.05 vs. Ⅰ-Ⅱ stage; △△ P<0.05 vs. medium/high differentiation    　　Survivin蛋白在卵巢上皮性癌中的表达与临床分期、组织学类型有关，而与病理类型无关。Ⅲ-Ⅳ期肿瘤Survivin蛋白表达水平、强度高于Ⅰ-Ⅱ期，P<0.05，差异有统计学意义；低分化肿瘤Survivin蛋白表达水平、强度都高于中、高分化的肿瘤，P<0.05，差异有统计学意义(表4)。

　　2.5  恶性卵巢上皮性肿瘤组织中Survivin蛋白和Pgp阳性表达的相关性分析  Pgp在Survivin阳性组中的表达率为60.71%(17/28)，在Survivin阴性组中的表达率为27.78%(5/18)，两者之间有统计学差异(χ2=0.785，P=0.008)，Survivin和Pgp的表达呈正性相关。

　　表4  Survivin的表达与卵巢上皮性癌患者各临床病理因素的关系（略）

　　Table 4  Association between clinicopathologic variables and survivin expression

　　△P<0.05 vs. Ⅰ-Ⅱ stage; △△ P<0.05 vs. medium/high differentiation

　　3  讨论    　　Pgp是多药耐药基因mdr1的表达产物，为ATP依赖型的药物外排泵，当化疗药物进入瘤细胞，Pgp将结构、作用机制不同的化疗药物结合并将其排出细胞，以维持细胞内药物浓度低于细胞毒水平，从而阻碍化疗药物作用的发挥，使瘤细胞耐药，其表达水平与耐药程度成正相关[2]。本研究Pgp在正常卵巢和卵巢良性肿瘤中未见阳性表达，说明卵巢并非Pgp的富集器官。本研究中46例卵巢上皮性癌组织中，即使未接触过化疗药，仍有16例Pgp表达阳性，说明Pgp基因表达除可被药物、放射线诱导产生外还有可能是卵巢恶性肿瘤所固有的表达，可能由于癌基因和抑癌基因改变使mdr1基因活化[3]。但Pgp在46例卵巢上皮性癌组织中表达率仅34.8%，表达量较低，这提示Pgp在卵巢癌原发性耐药机制中并不起主导作用[4]。    　　结构不同、作用靶点各异的抗肿瘤药物可诱导瘤细胞凋亡，凋亡受抑制可产生化疗药物耐药。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族中的一个成员,是至今发现的最强的凋亡抑制因子，通过直接或间接抑制caspase 3和caspase 7活性抑凋亡[5]，也可对抗广泛的凋亡诱导因素，如IL3缺失、Fas的激活，Bax、caspase 3、7、8和TNFα的过表达，包括对抗由化疗药物引起的凋亡，产生耐药[6]。Tetsuhisa等[7]研究发现诱导反义Survivin转导直肠癌细胞株，出现 Survivin表达下调，细胞增殖减少、凋亡增加，同时细胞对化疗药物敏感性增加。因此肿瘤细胞对化疗药物的敏感性可能与Survivin的表达直接相关。本研究得出Survivin在卵巢良性上皮性肿瘤中表达阳性率仅31.3%，而在癌组织中表达阳性率为60.9%，且其表达强度与临床分期、组织学分级呈显著相关，提示涉及Survivin的抗凋亡途径紊乱在卵巢上皮性癌发生、发展中起一定作用，也使细胞降低对化疗药物的敏感性产生耐药，从而揭示卵巢癌易产生耐药可能与化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力被抑制有关。但具体机制有待进一步研究。本研究结果提示Survivin和Pgp的表达呈正相关，表明卵巢癌组织中存在原发的耐药基因与抑制凋亡基因的共同表达现象。最新研究表明，Pgp可能参与了凋亡的过程。Pawlik等[8]利用Pgp抑制剂维拉帕米和Pgp特异性单克隆抗体可使化疗药物诱导凋亡减少。由于二者的相关性在国内外鲜有研究，二者共同调节机制仍需进一步探讨。共同表达是耐药相关基因受共同因子调控的证据。从一个侧面反映了卵巢癌多药耐药机制的复杂性，这也是卵巢癌多年来化疗未取得实质性进展的重要原因，同时亦为耐药逆转剂的研究提出新的课题。

【参考文献】  　　[1]Sally P, Wheatley, Iain A, et al. Survivin: A protein with dual roles in mitosis and apoptosis [J]. Inte Rev of Cytol, 2005, 247:3588.

　　[2]Walker J, Martin C , Callaghan R. Inhibition of Pglycoprotein function by XR9576 in a solid tumour model can restore anticancer drug efficacy [J]. Euro J Cancer, 2002, 40(4):594605.

　　[3]Jason Z, John J, Mandeep B, et al. Enhanced cellular accumulation of a Pglycoprotein substrate, rhodamine123, by caco2 cells using low molecular weight methoxypolyethylene glycolblockpolycaprolactone diblock copolymers [J]. Euro J Phar and Biopharmaceutics, 2002, 54(3):299309.

　　[4]Julio ED, Enrich C, Xavier GDM, et al. Expression of multidrug resistance proteins pglycoprotein, multidrug resistance protein 1, breast cancer resistance protein and lung resistance related protein in locally advanced bladder cancer treated with neoadjuvant chemotherapy: biological and clinical implications [J]. J Urol, 2003, 170(4):13831387.

　　[5]伍成奇，刘林潘，李姗姗，等. 病理性瘢痕组织中Survivin、P33ING1、Caspase3蛋白的表达 [J]. 郑州大学学报(医学版)，2006，41(6):10381041.

　　[6]Nadia Z, Maria GD. Survivin expression and resistance to anticancer treatments: perspectives for new therapeutic interventions [J]. Drug Resistance Updates, 2002,5(2):6572.

　　[7]Tetsuhisa Y, Yoshinobu M, Motoyuki N, et al. Downregulation of survivin expression by induction of the effector cell protease receptor1 reduces tumor growth potential and results in an increased sensitivity to anticancer agents in human colon cancer [J]. Euro J Cancer, 38(17):23162324. 　　　　[8]Pawlik A, Baskiewicz M, Machalinski B, et al. Involvement of Pgp in the process of apoptosis in peripheral blood mononuclear cells [J]. Inte Immunopharmacol, 2005, 5(5):821828.

基金项目：陕西省科技攻关基金资助项目 (No.2004K18G9a)