CB和MMP-9在上皮性卵巢肿瘤中的表达及相关性研究

作者:邢兰瑛,蔡东阁,方晓荷

作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院妇产科，陕西西安 710004

    【摘要】  　　目的 检测组织蛋白酶B(cathepsin B, CB)与基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP9)在人类上皮性卵巢肿瘤中的表达，探讨两者与卵巢癌细胞的分化增殖、侵袭转移的关系。方法 采用链霉素亲和生物素过氧化物酶法(SP)进行免疫组织化学染色，用CB抗体、MMP9抗体标记上皮性卵巢肿瘤组织标本，综合染色强度和阳性细胞占总体细胞数的百分比进行染色判定，结合有关病理特征进行分析。结果 经统计学分析，CB、MMP9在上皮性卵巢癌中的表达与年龄、病理类型无相关性(P>0.05)，而与卵巢癌的临床分期、有无转移及腹水呈正相关(P<0.05)；CB与卵巢癌的组织学分级呈正相关(P<0.05)；上皮性卵巢癌中CB和MMP9表达呈正相关(r＝0.652,P<0.05)。结论 CB、MMP9与卵巢癌的恶性生物学行为密切相关，两者在其侵袭转移过程中发挥了重要的协同作用。

【关键词】  上皮性卵巢肿瘤；组织蛋白酶B；基质金属蛋白酶9；侵袭转移

　　Study of expression and correlation of cathepsin B and matrix metallo proteinase 9 in epithelial ovarian tumor

　　Xing Lanying, Cai Dongge, Fang Xiaohe, Han Zhihong, Liu Min

　　(Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective  To study the expression of CB and MMP9 in ovarian tumor with the histodifferentiation and invasion and metastasis. Methods  The expressions of CB and MMP9 were detected by SP immunohistochemistry method in histological section of ovarian tumor, and the relationships between the results and the clinical pathological parameters of the patients were assessed. Results  The expression of CB and MMP9 had marked correlation (P<0.05) with clinical stage, metastasis and ascites of the ovarian cancer. Moreover, the expression of CB had marked correlation (P<0.05) with pathologic grade. The positive correlation was observed between the expression of CB and MMP9 (r＝0.652, P<0.05). Conclusion  The expression of CB and MMP9 in ovarian cancer cells is closely related to the tumor malignancy biological behaviour of ovarian cancer. They play an important synergistic action in the invasion and metastasis of ovarian cancer.

　　KEY WORDS: epithelial ovarian tumor; cathepsin B; matrix metalloproteinase9; invasion; metastasis

　　侵袭和转移是卵巢癌重要的生物学特征，是引起患者死亡的主要原因。随着对肿瘤病理的深入研究，人们认识到组织蛋白酶与基质金属蛋白酶的过表达与细胞癌变及侵袭转移有关，两者与肿瘤的关系成为国内外研究的热点。本课题通过分析组织蛋白酶B(cathepsin B, CB)与基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP9)在人类上皮性卵巢肿瘤中的表达情况，分析两者与卵巢癌组织侵袭转移、分化增殖的关系，探讨其在卵巢癌早期诊断中的作用，为抗癌药物的研究提供新的靶点，为卵巢癌患者预后及病情监测提供依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  从2002年5月至2006年3月在西安交通大学医学院第二附属医院和陕西省妇幼保健院妇产科接受初次手术治疗的上皮性卵巢癌患者32例(浆液性囊腺癌20例，黏液性囊腺癌12例)、交界性卵巢上皮性肿瘤患者9例(卵巢交界性浆液性囊腺瘤5例，卵巢交界性黏液性囊腺瘤4例)作为研究对象，年龄21-72岁，所有病例术前均无化疗、放疗、免疫治疗史，无毒物、药物、放射线、烟酒等危险因素接触史，无传染性肝炎、自身免疫性疾病史等其他合并症。按国际妇产科联盟(FIGO)1988年标准，在32例上皮性卵巢癌中，Ⅰ期7 例，Ⅱ期8 例，Ⅲ期9 例，Ⅳ期8 例。组织学分级：按3级标准，Ⅰ级12 例，Ⅱ级9 例，Ⅲ级11 例；有腹水22例，无腹水10例。选择同期在上述医院妇产科接受手术治疗并经组织病理学确诊的9例良性卵巢上皮性肿瘤(浆液性囊腺瘤5例，黏液性囊腺瘤4例)及同期手术中因其他良性疾病而切除的正常卵巢组织6例作为对照组，年龄19-69岁。

1.2  免疫组化染色方法及结果判定  兔抗人组织蛋白酶B单克隆抗体浓缩液，工作浓度1∶200，兔抗人MMP9单克隆抗体浓缩液，工作浓度1∶25，均购自武汉博士德生物工程有限公司。    　　CB免疫着色评估：CB 阳性表达于卵巢上皮细胞，呈弥漫分布的棕黄色颗粒，定位于细胞质或位于核周。综合染色强度和阳性细胞占总体细胞数的百分比进行半定量分析[1]。基本不着色0 分，着色淡1 分，着色适中2分，着色深3分；着色细胞占计数细胞的百分率≤5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分， ≥51%为3分。将每张切片平均着色程度得分与平均着色细胞百分率得分各自相乘为其最后得分，总分≥3分者为CB 阳性表达；总分<3分者为CB 阴性表达。    　　MMP9着色评估：MMP9染色阳性细胞为棕黄色颗粒或棕褐色颗粒，分布于胞浆，根据肿瘤细胞的细胞浆染色的程度及染色细胞百分率进行评分[2]。随机选取5个高倍(400倍)视野，基本不着色0分，着色淡黄色1分，棕色2分，深棕色3分；高倍视野下着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，≥51为3分，>75%为4分。将每张切片的着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘为其最后得分。染色强度与阳性细胞所占百分比乘积>3分记为(+)，6-9分为()，12分为()。凡(+)或以上者均为阳性表达。

　　1.3  统计学处理  SPSS11.5软件分析，采用χ2检验及Fisher确切概率法，CB与MMP9表达的相关性分析用Sperman等级相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  CB及MMP9在正常卵巢组织及上皮性卵巢肿瘤中的表达情况  CB及MMP9染色阳性细胞为棕黄色颗粒或棕褐色颗粒，分布于胞浆(图1)，两者表达从良性组、交界性组、恶性组呈现逐渐升高的趋势，恶性组分别与正常组、良性组、交界性组间有显著性差异(P<0.05)

　　图1  CB及MMP9在上皮性卵巢癌中的表达（略）

　　Fig.1 The expression of CB and MMP9 in epithelial ovarian cancer

　　A: the expression of CB in serous cystadenocarcinoma; B: the expression of CB in mucinous cystadenocarcinoma; C: the expression of  MMP9 in serous cystadenocarcinoma; D: the expression of MMP9 in mucinous cystadenocarcinoma

　　2.2  CB、MMP9的表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系  见表1。CB、MMP9表达与患者年龄、病理学类型无明显关系(P>0.05)；在临床分期晚、体内有腹水或发生转移病例中其表达增高，且有显著性差异(P<0.05)。组织学分化程度越低，CB表达越高，具有显著性差异(P<0.05)；而MMP9的表达与组织学分级无关(P>0.05)。

　　2.3  CB和MMP9表达的相关性  32例上皮性卵巢癌组织中同时有CB 、MMP9表达的有18例，经相关性分析显示，患者卵巢癌组织中CB 和MMP9的表达二者呈正相关(r＝0.652,P<0.05)。

　　表1  CB、MMP9表达与卵巢癌临床病理特征间的关系（略）

　　Table 1  The relationship between the expression of CB and MMP9 in ovarian cancer and the clinical indexes

　　*P<0.05 vs. next line

　　3  讨论    　　目前发现肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)的相互作用在肿瘤浸润、转移中至关重要。瘤细胞由原发瘤分离，侵入细胞外基质与其中一些大分子蛋白成分黏附，溶解细胞外基质，经ECM缺损处向外扩散，穿过ECM侵犯周围组织进入循环系统，促进肿瘤的侵袭转移。CB与MMP9在此过程中发挥了重要的作用。    　　CB属于半胱氨酸蛋白酶家族，为一肽链外切酶，在溶酶体的酸性环境中，其活性位点呈闭合环状态。当pH值升高时，闭合环状结构打开，从而成为肽链内切酶，在溶酶体降解蛋白质途径中发挥着必不可少的作用。有许多研究证明，CB在多种恶性肿瘤中有较高的表达,并且在结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞中发现，CB过表达在肿瘤侵袭边缘最为显著，且其mRNA的表达与癌的组织学类型、临床分期、分化阶段有一定的关系[35]。另有研究证实，下调或沉默CB在恶性肿瘤细胞中的表达,肿瘤细胞的侵袭能力则大大减弱[67]。本研究结果显示，CB在正常卵巢和良性卵巢肿瘤中不表达，在交界性卵巢肿瘤中有少量表达，而在上皮性卵巢癌中呈高表达，提示CB参与了上皮性卵巢癌的发生、发展过程。本研究还表明，CB的表达与卵巢癌的临床分期、组织学分化程度、有无转移及有无腹水有关，临床分期越高、组织学分化程度越低，CB的表达越强，发生转移及产生腹水者其CB表达程度均增强。提示CB参与了卵巢癌的侵袭、转移过程。已有证据表明CB可能通过降解细胞外基质蛋白，促进肿瘤新生血管的形成等参与了恶性肿瘤的侵袭和转移过程[6]。

MMP9是一组结构中含锌离子和钙离子的蛋白水解酶，研究表明，MMP9在多种恶性肿瘤中呈现过表达，且MMP9的表达与肿瘤的临床分期、病理分级、淋巴结转移及预后等有关[810]。本研究结果显示，MMP9在正常卵巢组织、良恶性卵巢肿瘤中均有表达，但在恶性上皮性卵巢肿瘤中表达显著增高。本研究还显示，MMP9的表达与患者年龄、病理类型及组织学分级之间无相关性，其随卵巢癌临床分期的增高而明显增加，且在体内出现胸腹水或发生转移的组织中表达程度增强，提示MMP9促进了卵巢癌的侵袭转移。众多研究也表明了上调MMP9活性，肿瘤侵袭转移能力增强，反之，给予外源性重组TIMP1可使瘤细胞株侵袭能力显著下降[11]。其作用机制可能是降解ECM上的Ⅳ型胶原，促进恶性肿瘤新生血管的形成及肿瘤细胞及与宿主细胞间的黏附性，从而促使肿瘤的侵袭转移。     　　蛋白水解酶既可以单独作用，也能相互作用，近年来在对肿瘤的研究中可检测到一些蛋白酶的共表达。不同蛋白酶在肿瘤生长、浸润、迁移和血管生成等方面发挥独特的作用，通过蛋白水解级联反应，其间的相互协调作用对肿瘤细胞侵袭转移是必需的[12]。本实验结果显示：CB与MMP9在上皮性卵巢癌组织中表达的共同特征是在癌细胞中过表达，有淋巴结转移和腹水者表达均增加，而在正常卵巢组织中不表达或弱阳性表达。CB与MMP9表达一致性较好，两者呈正相关，说明两者在上皮性卵巢癌的发生发展、侵袭转移过程中具有协同作用。

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