基质金属蛋白酶9在宫颈癌中的表达及意义

作者：姚安梅,高尚风,王晓敏

作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇产科；陕西省肿瘤医院，陕西西安 710061

   【摘要】  目的 探讨基质金属蛋白酶9(MMP9)蛋白在宫颈癌中的表达及意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测MMP9蛋白在18例正常宫颈上皮、20例宫颈原位癌、55例宫颈浸润癌中的表达。结果 MMP9在宫颈浸润癌中的表达率明显高于正常宫颈组织和宫颈原位癌(P<0.05)，而正常宫颈组织和宫颈原位癌组织之间无显著性差异(P>0.05)。MMP9的表达与宫颈鳞癌不同临床分期、肿瘤大小、病理分级无显著性差异(P>0.05)，而在宫颈浸润不同深度间及有无淋巴转移的差异有显著性(P<0.05)。结论 MMP9在宫颈浸润癌中呈高表达，MMP9可能通过降解破坏细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)而发挥促进宫颈癌发生、发展、浸润转移的作用。

【关键词】  基质金属蛋白酶9(MMP9)；宫颈癌；免疫组化

　　The expression and significance of MMP9 in cervical cancer

　　Yao Anmei, Gao Shangfeng, Wang Xiaomin, Wang Ying

　　(Department of Gynecology & Obstertrics, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University; Shaanxi Province Cancer Hospital, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective  To study the expression and significance of matrix metalloproteinase9 (MMP9) in cervical cancer. Methods  The expression of MMP9 protein was tested by using immunohistochemical SP method in 18 cases of normal cervical epithelium, 20 cases of carcinoma in situs of cervix, and 55 cases of invasive cervical cancer. Results  The expression of MMP9 protein in invasive cervical cancer was higher than that in normal cervical tissue and carcinoma in situs of cervix (P<0.05). There was no significance difference in MMP9 expression between normal cervical tissue and carcinoma in situs of cervix (P>0.05). The expression of MMP9 protein was not related to clinical stages, the size of tumor and pathological grading of invasive cervical cancer (P>0.05), but it was associated with the depth of invasive cervical and lymph node metastases (P<0.05). Conclusion  The expression of MMP9 was high in cervical cancer. MMP9 may degradate extracelluiar matrix (ECM) and basilemma (BM), thus promoting development and progress, and metastasis of cervical cancer.

　　KEY WORDS: matrix metalloproteinase 9 (MMP9); cervical cancer; immunohistochemistry

　　在肿瘤侵袭、转移过程中，细胞外基质(extracelluiar matrix, ECM)的降解是肿瘤侵蚀正常组织和开始转移的重要途径。ECM的降解依靠蛋白水解酶，这些蛋白水解酶主要可分为4类，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是其中较为重要的一类。MMP9是MMPs家族中的重要一员，又称Ⅳ型胶原酶或明胶酶B，在MMPs家族中分子量最大，无活性的前体分子的分子量为92ku，具有酶学活性的蛋白质分子量为82ku，人类MMP9位于染色体20q12-q13，基因全长4506bp。大量研究表明，MMP9在多种恶性肿瘤中呈过度表达，降解破坏ECM中最主要组份Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，与肿瘤的浸润转移密切相关[1]。本研究通过免疫组织化学SP法检测MMP9在正常宫颈组织、宫颈原位癌、宫颈浸润癌中的表达，以探讨MMP9在宫颈癌浸润和转移中的作用及其临床价值。

　　1  材料与方法

1.1  临床资料  18例正常宫颈组织、20例宫颈原位癌及55例宫颈浸润鳞癌标本均来源于陕西省肿瘤医院2001年1月-2005年11月手术标本或宫颈活检标本，均未行放疗或化疗，临床及病理资料完整，年龄32-64岁，平均年龄49.2岁。按国际妇产科联盟(FIGO)的标准，55例宫颈浸润癌Ⅰ期22例(40.0%)，Ⅱ期33例(60.0%)。病理分级Ⅰ级8例(14.5%)，Ⅱ级33例(60.0%)，Ⅲ级14例(25.5%)。肿瘤直径≥4cm者32例(58.2%)，肿瘤直径<4cm者23例(41.8%)。浸润宫颈壁<2/3者18例(32.7%)，浸润宫颈壁≥2/3者37例(67.3%)。盆腔淋巴转移者19例(34.5%)，盆腔淋巴未转移者36例(65.5%)。

　　1.2  主要试剂  兔抗人MMP9多克隆抗体(浓缩型，用时稀释为1∶100)、免疫组织化学染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3  实验方法  标本经100mL/L福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，厚5μm，并行常规HE染色经病理科专家阅片复诊。免疫组织化学SP法按试剂盒说明书进行。组织切片脱蜡至水，PBS缓冲液振洗3min×3；置于耐高温切片架上，放入已沸腾的高压锅中进行组织抗原热修复，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时，2min后压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，蒸馏水冲洗两次，PBS液振洗3min×3；30mL/L H2O2去离子水消除内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10min，PBS缓冲液振洗3min×3；正常山羊血清封闭，室温孵育15min；加适当比例稀释的第一抗体，37℃孵育2h，PBS缓冲液振洗3min×3；加生物素标记的第二抗体，37℃孵育15min，PBS缓冲液振洗3min×3；加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min，PBS缓冲液振洗3min×3；DAB显色，苏木素浅染，脱水，封片，镜检。阴性对照为用PBS取代一抗，阳性对照为已知阳性片。

　　1.4  结果判定标准  采用半定量积分法，MMP9染色阳性为细胞浆淡黄至棕黄色。每张切片随机选取5个不同的视野(×400)，分别计数阳性细胞数并计算其算术平均值。分级标准：阳性细胞数<5%，0分；6%-25%，1分；26%-50%，2分；>50%，3分。着色程度：无，0分；淡黄，1分；棕黄，2分；棕褐，3分。将每张切片阳性细胞数与着色程度的得分相乘为最后得分。0-1 分为阴性(-)，2-3分为弱阳性(+)，4-5分为中度阳性()，6分以上为强阳性()。由高年资病理科医师在多头显微镜下共同阅片并打分。最后得分≥2者均判定为阳性表达。

　　1.5  统计学处理  对所得数据以DAS ver1.0 (Drug And Statistics for Windows)统计软件包进行卡方检验、两组等级资料秩和检验，以α=0.05为检验水准。

　　2  结果

　　2.1  MMP9在宫颈组织中的表达  MMP9蛋白主要定位于细胞浆。MMP9在宫颈浸润癌组织中多为中到强阳性表达，在肿瘤周围间质中的成纤维细胞有弱到中度阳性表达，还可见于中性粒细胞、巨噬细胞、浆细胞、多核巨细胞。在浸润癌中MMP9的表达强于原位癌及正常对照(图1)。统计学分析显示MMP9在宫颈浸润癌中表达率明显高于正常宫颈组织(P=0.00)和宫颈原位癌(P<0.05)，有显著性差异；宫颈原位癌与正常宫颈组织的阳性表达率无显著性差异(P>0.05，表1)。

　　图1  MMP9在宫颈癌中的表达（略）

　　Fig.1 The expression of MMP9 in cervical cancer (SP, ×400)

　　A: negative expression of MMP9 in cervical cancer; B: weak expression of MMP9 in cervical cancer; C: intense expression of MMP9 in cervical cancer

　　2.2  MMP9在宫颈癌中的表达与宫颈癌临床病理参数的关系  宫颈浸润癌中， MMP9在不同病理分级组、分期组及肿瘤大小组的表达均无显著性差异(P>0.05)。而淋巴转移组的表达率明显强于无转移组(P<0.05)，宫颈浸润深度≥2/3的阳性表达率亦强于宫颈浸润深度<2/3，有统计学意义(P<0.05，表2)。

表1  不同宫颈组织中MMP9的表达（略）

　　Table 1  The expression of MMP9 in different tissues of the cervix

　　*P<0.05 vs. normal cervix; △P<0.05 vs. carcinoma in situs of cervix

　　表2  MMP9 表达与宫颈癌临床病理参数的关系（略）

　　Table 2  The relationship between the expression of MMP9 and clinical pathological parameters in cervical cancer

　　*P<0.05

　　3  讨论    　　肿瘤侵袭与转移是涉及肿瘤细胞与ECM之间相互作用的多步骤分子生物学变化过程[2]。肿瘤细胞与基底膜(BM)表面受体结合，释放各种水解酶降解ECM，瘤细胞伸出伪足向被蛋白酶降解的区域运动，在继发处形成转移灶。其中MMPs是重要的在多种肿瘤细胞中表达较高的降解ECM的酶。有研究发现，在BM未被降解和出现恶性病变时，肿瘤组织中已发现MMPs的表达上调并活化[3]。MMP9是MMPs家族的重要一员，由多种细胞分泌的糖化蛋白，包括恶性肿瘤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、毛细血管内皮细胞和滋养细胞及一些正常细胞。MMP9基因的正常表达具有调控和维持正常组织功能的特点，但在恶性瘤组织中，这一调控作用消失，成为肿瘤细胞侵袭和转移等病理过程发生的原因。    　　Sheu等[4]研究发现，在宫颈鳞癌中MMP9的表达升高，且随着病程不断进展，其表达逐渐升高，且MMP9活性与淋巴管浸润和淋巴结转移显著正相关，并与宫颈鳞癌的复发成正相关，提示MMP9的表达与预后相关。Jiang等认为MMP9有促进宫颈癌肿瘤血管新生、癌细胞增殖、浸润和转移的作用，可作为评估宫颈癌患者预后的指标。Enrico等[5]用RTPCR检测发现宫颈上皮内瘤样病变Ⅲ级(CINⅢ)和鳞癌组织中的MMP9的表达较CINＩ/Ⅱ组织中显著升高。本组研究结果显示，MMP9在正常宫颈组织、宫颈原位癌、宫颈浸润癌中的表达率分别为22.2%、45.0%、78.2%，即随着宫颈癌发生、发展，MMP9呈递增趋势。MMP9在宫颈浸润癌中的表达率明显高于正常宫颈癌和宫颈原位癌(P<0.05)，而正常宫颈组织和宫颈原位癌组织之间无显著性差异(P>0.05)。这与文献报道肿瘤组织中MMP9大多数呈高表达相一致。    　　宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，发病率在发展中国家女性恶性肿瘤中排第2位，在发达国家居第5位[6]，严重地威胁着妇女的健康。宫颈癌的预后与某些临床及病理因素有关，包括临床分期、宫颈肿瘤大小、组织学类型、分化程度、深肌层浸润深度、宫旁及阴道切缘状况、脉管癌栓、淋巴结转移、种族、年龄、是否进行规范化治疗等[79]。其中肿瘤大小、深肌层浸润和淋巴结转移是影响预后的重要因素[10]。宫颈癌的手术范围与术式是多年来备受关注的问题，其中淋巴结清扫的意义更是争论的热点。因此在治疗前综合肿瘤指标、临床及病理等特征进行病情判断、淋巴结转移风险评估，是宫颈癌治疗中不可缺少的一步。何金英等[11]研究认为，宫颈癌中MMP9的表达与病理分级、盆腔淋巴结转移有关，而与临床分期、病理类型无关。欧阳运薇等[12]研究发现，MMP9的表达与临床分期、组织学分级、病理类型均无相关性，MMP9的表达与宫颈癌淋巴转移有关。本研究结果显示淋巴转移组的MMP9的阳性表达率100%，无淋巴转移组的MMP9的阳性表达率66.7%，淋巴转移组的表达率明显强于无转移组，有统计学意义(P<0.05)；同样MMP9的表达与宫颈浸润深度有关(P<0.05)，而与宫颈鳞癌不同临床分期、肿瘤大小、病理分级间无显著差异(P>0.05)，但MMP9在宫颈浸润癌病理分级Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组中的表达率分别为50.0%、78.8%、92.9%，即随着病理分级的增加其表达率呈上升趋势。    　　本实验结果提示MMP9与肿瘤的浸润转移密切相关，有可能用来预测宫颈癌的浸润深度、淋巴结转移状况，如能与临床相结合可帮助选择较合理的手术方式等治疗。

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