核受体共激活因子AIB1在子宫内膜癌组织中的表达及其意义

作者:王翠秀

作者单位：内蒙古医学院附属医院妇产科，内蒙古 呼和浩特 010050

    【摘要】  目的 研究子宫内膜癌组织中核受体共激活因子（AIB1）mRNA和蛋白质的表达及其意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，检测51例子宫内膜癌、13例不典型增生子宫内膜、15 例复合型增生子宫内膜、19 例单纯型增生子宫内膜和18例正常子宫内膜组织中AIB1 mRNA表达；同时采用免疫组化技术检测AIB1蛋白的表达。结果 子宫内膜癌组织中AIB1呈过表达状态。内膜癌组织中AIB1 mRNA阳性表达率和相对表达水平明显高于增生子宫内膜组织及正常子宫内膜组织（χ2=11.025，F=6.930，P<0.01）。不典型增生子宫内膜组织中AIB1 mRNA阳性表达和相对表达水平高于复合性增生内膜组织和单纯性增生内膜组织（χ2=6.133，F=4.213，P<0.05）。内膜癌组织中AIB1蛋白阳性表达率明显高于增生内膜组织和正常子宫内膜组织（χ2=13.546，P<0.01）。子宫内膜癌组织、异常增生内膜组织及正常子宫内膜组织间AIB1蛋白表达强度不同，三者间比较差异有显著性（H=6.023,P<0.01）。AIB1蛋白表达强度在子宫内膜癌组织中呈现过表达，在不典型增生内膜组织中为高表达，在正常组织中为阴性表达或弱表达；AIB1 mRNA和蛋白的过表达与肿瘤的病理类型、组织学分级、淋巴结转移和病人的年龄无关(P>0.05)，但与肿瘤组织的肌层浸润深度及ERα蛋白表达有关（χ2 =4.832、4.674，t′=2.201、2.362,P<0.05）。结论 AIB1过表达发生在子宫内膜癌的早期和癌前病变阶段，过表达的AIB1可能在子宫内膜癌癌变发展过程中发挥作用。

【关键词】  子宫内膜肿瘤 核受体共激活因子 逆转录聚合酶链反应

    EXPRESSION OF NUCLEAR RECEPTOR COACTIVATORS AIB1 IN ENDOMETRIAL CARCINOMASWANG CUIXIU, WANG YANKUI, YANG LING, et al （Department of  Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Huhehaoter  010050, China ） ［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the expression of nuclear receptor coactivator AIB1 in endometrial carcinoma and to analyze its significance.MethodsAIB1 expressions were assessed via semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) and immunohistochemistry in tissues of normal endometrium (n=18), hyperplasia endometrium (n=47) and endometrial carcinoma (n=51).ResultsThe expression rate of AIB1 mRNA in endometrial carcinoma was significantly higher than that in hyperplastic and normal endometrium (χ2=11.025，F=6.930，P<0.01). The expression of AIB1 mRNA in atypically hyperplastic endometrium was significantly higher than that in complex/simple hyperplasia (χ2=6.133，F=4.213，P<0.01). The expression of AIB1 in endometrial carcinoma was significantly higher than that in hyperplastic and normal endometrium (χ2=13.548，P<0.01). The expression of AIB1 mRNA and protein was not related to pathological stage, pathological subtype, lymphatic metastasis, and the patients’age (P>0.05), but related to the depth of myometrial infiltration（χ2 =4.832，4.674;t′=2.201,2.362;P<0.05).ConclusionOverexpression of AIB1 occurs in endometrial carcinoma at the early stage of the disease which might play an important role in carcinogenesis of endometrial carcinoma.

［KEY WORDS］endometrial neoplasms; nuclear receptor coactivator; reverse transcriptase polymerse chain reaction

    子宫内膜癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。大约80%子宫内膜癌的发生与雌激素有关，且已公认它是一种通过雌激素受体发挥作用的激素依赖性肿瘤。越来越多的研究显示，雌激素受体（ER）阳性与肿瘤的分化程度有关，ER状态是反映子宫内膜癌细胞对内分泌治疗、放疗和化疗应答的重要预测指标[1～5]。由此可见，雌激素雌激素受体的信号传导通路是子宫内膜癌治疗和预防的重要靶位点，而涉及该通路的重要元件核受体共调节蛋白因子亦首当其冲地成为目前研究的重点。本研究针对目前国外研究比较集中且具有代表 性的核受体共激活因子（AIB1），通过采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和免疫组化方法技术，分别检测子宫内膜癌、增生子宫内膜和正常子宫内膜组织标本中AIB1 mRNA和蛋白的表达情况，并结合临床病理特征，探讨其在子宫内膜癌组织中表达的意义。

    1  材料与方法

    1.1  材料来源

    2003年10月～2004年12月，青岛大学医学院附属医院妇科收治的子宫内膜癌病人手术标本51例。病人年龄32～75岁，平均45岁；根据子宫内膜癌手术病理分期：Ⅰ 期34例,Ⅱ 期11例，Ⅲ 期6例；组织学分级：G126例，G215 例，G310例；组织学类型：子宫内膜样腺癌41例，其他病理类型10例。另取同期18例子宫颈原位癌行子宫切除术的正常子宫内膜标本，以及门诊行分段诊刮病人内膜组织标本，其中19例为单纯性增生、15例为复合性增生及13例为不典型增生。所有病人在取标本之前均未接受放射治疗、化学药物治疗及性激素治疗。切除组织均经病理学证实诊断，子宫内膜癌手术病理分期按照FIGO（1988）标准，组织学分级按照WHO标准，增生性子宫内膜按照WHO(1994)分类。

    1.2  标本收集与处理

    新鲜标本离体后，取1.5 g立即置于-70 ℃冰箱保存，同时取材以40 g/L甲醛固定，用于病理诊断和免疫组化检测。

    1.3  实验方法

    1.3.1  RTPCR技术检测AIB1 mRNA的表达组织总RNA提取及cDNA合成：总RNA提取参照TRIzol试剂盒 (美国GIBCOBRL公司产品)说明书中一步法进行。cDNA合成参照反转录试剂盒 (美国PROMEGA公司产品 )说明书进行。 PCR反应：参照文献[1～3]设计PCR引物。AIB1U primer上游引物序列为5′ATACTTGCTGGATGGTGGACT3′（positions 110～130， GenBank accession no. AF012108)，AIB1L primer 下游引物序列为5′TCCTTGCTCTTTTATTTGACG3′（positions438～458; GenBank accession no.AF012108)，扩增产物片断长度为349 bp。内参照葡萄糖磷酸脱氢酶（GAPDH）上游引物序列为5′AAGGTCGGAGTCAACGGATT3′，下游引物序列为5′CATGAGTCCTTCCACGATAC3′,扩增产物片断长度为513 bp。AIB1的PCR扩增反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，53 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。产物分析：所有标本在513 bp处产生GAPDH扩增条带，证明RNA提取和逆转录是成功的。10 μL PCR产物置于20 g/L的琼脂糖凝胶(0.5 mg/L 溴化乙锭染色)上进行电泳，紫外线透照仪下观察并照相，扩增出349 bp和513 bp条带者为阳性表达。电子计算机图像分析仪(VIDAS 2.1型德国OPTON公司产品)对目的基因及内参照图像进行积分吸光度（A）分析。本研究以AIB1/GAPDH条带的吸光度比值代表AIB1 mRNA的相对表达水平。

    1.3.2  链霉菌抗生物素蛋白过氧化物连接（SP）法检测AIB1蛋白  参考文献[4]，以乳癌MCF7细胞涂片作为AIB1蛋白表达阳性对照。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。AIB1山羊抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruze公司，SP免疫组化染色试剂盒（SP9003）为北京中杉生物技术有限公司产品。实验步骤严格按照说明书进行。免疫组化结果判断：细胞浆或细胞核内出现棕黄色颗粒者判断为阳性细胞。AIB1蛋白阳性染色大部分以胞浆为主，部分胞核染色；阳性判断采用Sinicrope改良法[2]。

1.4  统计学方法

    应用SPSS 11.0软件进行统计学分析。计量资料比较采用t检验、方差分析和q检验，计数资料比较采用χ2检验和H检验。

    2  结    果

    2.1  AIB1 mRNA在正常子宫内膜、增生子宫内膜及子宫内膜癌中的表达

    正常子宫内膜、异常增生子宫内膜和子宫内膜癌组织中均可检测到AIB1 mRNA的表达（图1）。正常子宫内膜、异常增生子宫内膜和子宫内膜癌3组不同子宫内膜组织AIB1 mRNA阳性表达率比较，差异有显著性（χ2=11.025,P<0.01）；3组不同子宫内膜组织AIB1 mRNA的相对表达水平比较，差异有显著性（F=6.930,P<0.01），子宫内膜癌组织中AIB1 mRNA相对表达水平高于正常子宫内膜和异常增生子宫内膜组织（q=4.682、3.909,P<0.01）。单纯性增生、复合性增生及不典型增生内膜组织中AIB1 mRNA阳性表达率比较，差异有显著意义（χ2=6.133，P<0.05）；三者间AIB1 mRNA相对表达水平比较，差异有显著意义（F=4.213，P<0.05）,不典型增生内膜组织AIB1 mRNA相对表达水平高于单纯性增生和复合性增生内膜组织（q=  3.848、4.464,P<0.01）。见表1。表1  不同类型子宫内膜组织中AIB1 mRNA表达比较分

    2.2  AIB1蛋白在正常子宫内膜、增生子宫内膜及子宫内膜癌中的表达

    AIB1蛋白阳性染色主要位于腺上皮细胞及癌细胞的胞浆内，呈黄褐色弥漫性分布，少数为细胞核染色（图2）。正常子宫内膜、异常增生子宫内膜和子宫内膜癌组织中AIB1蛋白阳性表达率比较，差异有显著性（χ2=13.546，P<0.01）；3组不同子宫内膜组织AIB1蛋白的表达强度比较，差异有显著意义（H=6.023，P<0.05），子宫内膜癌组AIB1蛋白表达强度高于正常子宫内膜和增生子宫内膜组织。不典型性增生、单纯性增生和复合性增生子宫内膜组织中AIB1蛋白阳性表达率比较，差异有显著性（χ2 = 6.311，P<0.05）；不典型性增生子宫内膜组织中的AIB1蛋白表达强度高于单纯性增生和复合性增生内膜组织，三者相比较差异有显著意义（H=7.091,P<0.05）。见表2。

  　2.3  AIB1 mRNA及其蛋白的表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系

    肌层浸润深度≥1/2 子宫内膜癌组织AIB1 mRNA的表达水平明显高于肌层浸润深度＜1/2子宫内膜癌组织，二者间比较差异有显著性（t′=2.201,P<0.05）。肌层浸润深度≥1/2子宫内膜癌组织者AIB1蛋白表达阳性率明显高于肌层浸润深度＜1/2的子宫内膜癌组织，二者间比较差异有显著性（χ2 =4.832，P<0.05）。子宫内膜癌组织中AIB1 mRNA及其蛋白的表达水平与肿瘤的各手术病理分期、病理分级及各种病理类型、是否有淋巴结转移以及病人绝经否均无相关性(F=1.365～2.453，χ2=0.204～0.834,P>0.05);ERα蛋白表达阳性的子宫内膜癌组织中AIB1 mRNA表达水平及蛋白阳性表达率明显高于ERα蛋白表达阴性的内膜癌组织，二者间差异有显著性(t′=2.362,χ2=4.674,P<0.05)。见表3。表2  不同类型子宫内膜组织中AIB1蛋白表达比较分表3  子宫内膜癌组织中AIB1 mRNA及其蛋白表达与临床病理特征的关系病理特征nAIB1 mRNA表达n相对表达水平

    3  讨    论

    3.1  AIB1 mRNA概述

    AIB1是类固醇激素受体共激活因子(SRC)家族中的一员,又称SRC3。AIB1位于人类染色体20q12，由于其在 5%～10%的乳癌中存在扩增而得名[5,6]。AIB1以配体依赖的形式作用于ER/ERα复合物，通过多种机制增强靶基因的转录和表达。AIB1广泛表达于正常心肌、胰腺、胃、前列腺等组织中[7]，其对正常细胞尤其是生殖细胞的生长是必需的；但在乳癌、卵巢癌、前列腺癌等激素依赖性肿瘤组织中存在过表达，亦有关于其在子宫内膜癌组织中过度表达的报道[8]。其过表达的原因可能为基因扩增或基因突变[9]。研究表明，过表达AIB1可能为组织癌变的促发因素之一[5，9]。AIB1异常表达不仅涉及到激素依赖性肿瘤促癌变的发生，还与该类病人的内分泌治疗敏感性和预后相关。

3.2  子宫内膜癌组织中AIB1 mRNA表达其意义

    AIB1的研究已突破传统核受体、癌基因和抑癌基因方面的研究，从分子水平着手于核受体信号传导通路，更加深入地探索了子宫内膜癌发生、发展的分子机制。本研究结果显示,子宫内膜癌中AIB1 mRNA和蛋白的阳性表达率和表达水平显著高于增生和正常子宫内膜组织;不典型性增生内膜组织AIB1 mRNA相对表达水平高于单纯性增生内膜和复合增生性内膜组织，说明AIB1表达的增高发生在子宫内膜癌的早期癌前病变阶段。通过AIB1蛋白免疫组化结果分析，AIB1蛋白表达强度在子宫内膜癌组织中呈现过表达，不典型性增生内膜组织中为高表达，在正常组织中为阴性表达或弱表达。由此，我们认为，子宫内膜癌组织中AIB1呈过表达状态。AIB1表达的异常可能为癌变的促发因素之一。GLAESER等[8]和KERSHAH等[10]研究亦认为，癌变内膜组织中AIB1的表达明显高于正常内膜，呈过度表达状态，故认为其可能在癌变发生过程中发挥促进作用，为促癌变因素之一。从研究结果看，RTPCR和免疫组化方法对AIB1表达的检测结果也存在一些差异，分析这种差异可能为基因转录、翻译过程中受到某种特殊因素的影响所致。

    结合子宫内膜癌的临床病理特征分析显示，AIB1 mRNA和蛋白的表达与子宫肌层的浸润深度具有明显相关性，此说明过度表达的AIB1可能参与细胞的异常生长增殖，对肿瘤的形成及其局部侵袭能力具有一定的促进作用。此与BGE等[11]的研究结果相同。由此，我们可以认为在内膜癌组织中AIB1表达水平越高，其深肌层浸润的可能性越大。因深肌层浸润（≥1/2）本身就是内膜癌预后不良的因素之一，就此可以结合其他预后不良指标及高危因素综合判断预后及指导临床治疗。绝经与否及病理类型并不是AIB1过表达的相关因素。分析其原因，临床上80％子宫内膜癌发生于绝经后妇女[12]，且多为Ⅱ型非雌激素依赖性病人；而绝经前或围绝经期Ⅰ型子宫内膜癌及子宫内膜样腺癌病人，其发病原因大多与单一雌激素过度刺激而无孕激素拮抗有关。AIB1过表达与内膜癌病人绝经与否及病理类型因素无相关性的结果间接证明，过表达AIB1通过多种不同的致癌机制发挥促癌变作用。由于其他病理类型子宫内膜癌临床相对少见，本研究中较小样本资料可能使实验结果产生偏差。因此，需要我们收集更多的临床资料，进行更多的相关临床研究。组织学分级、淋巴结转移均不是AIB1过表达的相关因素，说明AIB1过表达强度可能不参与肿瘤细胞的分化及恶性转移过程。子宫内膜癌组织中，AIB1的过表达与ERα蛋白表达阳性相关；鉴于AIB1过表达为内膜癌不良预后因素之一，我们借以分析内膜癌病人ERα阳性表达而内分泌治疗效果差、原发耐药的原因可能为AIB1过表达所致。

    本研究结果表明，过度表达的AIB1基因可能是子宫内膜癌变的促发因素之一，其涉及病人临床预后。对于AIB1过度表达的病因、过表达AIB1致癌具体机制及是否参与靶基因转录和翻译后修饰，都是需要进一步研究解决的问题。

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