血清精子蛋白17检测的双抗夹心ELISA法及在卵巢癌诊断中的应用

作者:缪家文,李芳秋,杨爱龙  作者单位：1. 镇江市第三人民医院中心实验室,江苏 镇江212019; 2. 南京军区南京总医院全军医学检验中心， 江苏 南京 210002

    【摘要】  　　目的： 建立双抗夹心ELISA法检测血清中精子蛋白17（sperm protein 17, Sp17）水平。方法： 以重组Sp17蛋白为免疫原制备兔抗Sp17抗体，建立Sp17双抗夹心ELISA检测方法，鉴定其最小检出限、精确度、回收率，并检测42例正常人及28例卵巢癌患者血清Sp17水平。结果： 该双抗夹心ELISA法敏感度高、特异性强、重复性好。卵巢癌患者与正常人血清Sp17含量有显著差别（P<0.01），正常人血清中存在少量Sp17蛋白，而卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高者占39.3%。结论： 卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高。测定血清Sp17水平的ELISA方法学确立为阐明Sp17在卵巢癌患者中的免疫生物学意义提供了实验手段。

【关键词】  精子蛋白17（Sp17）　卵巢癌　ELISA

　　Development of double antibodies sandwich ELISA method for detecting Sp17 in serum and its primary clinical application

　　MIAO Jiawen， LI Fangqiu， YANG Ailong

　　1.Centre of Clinical Laboratory,the Third Hospital of Zhenjiang, Zhenjiang Jiangsu 212019;

　　2.Center of Medical Laboratory Sciences of PLA, Nanjing General Hospital of Nanjing Command, Nanjing 210002, China

　　［Abstract］  Objective: To develop double antibodies sandwich ELISA for detecting sperm protein 17（Sp17）in serum and investigate clinical significance of serum Sp17 for ovarian carcinoma.Methods： Prepared rabbit antiserum of Sp17 by using a purified recombinant Sp17 protein as antigen, double antibodies sandwich ELISA for serum Sp17 was established and serum Sp17 was detected in ovarian carcinoma and normal control. Results： Sp17 polyclonal antibody was preparationed and it′s specificity with Sp17 in human testis was confirmed by immunohistochemistry. The double antibodies sandwich ELISA for serum Sp17 has been high sensitive, repeated and specific. There are obvious differences comparing ovarian carcinoma group with normal control group (P<0.05). The serum Sp17 level in 39.3% ovarian carcinoma was significantly high. Conclusion： The serum Sp17 level in ovarian carcinoma was significantly higher than in healthy persons. The establishment of ELISA method for serum Sp17 provides the experimental means to illustrate the imunobiological significance of Sp17 in ovarian carcinoma.

　　［Key words］  sperm protein 17 (Sp17)； ovarian carcinoma； ELISA

    精子蛋白17（sperm protein 17, Sp17）是一种高度保守的睾丸特异性蛋白，人体其他正常组织极少表达Sp17［1］。近期研究发现，Sp17在部分卵巢癌和多发性骨髓瘤组织以及其他一些肿瘤细胞系中异常表达，是一种新的肿瘤相关抗原，这使其可能成为肿瘤诊断新的标志［2～3］。对Sp17水平的检测一般采用免疫组化、RTPCR和Westernblot等方法［4～6］，这些方法分别存在着需要获取组织标本、操作复杂、需要特殊仪器或不适用于大样本人群等问题。我们在本实验室原核表达并纯化了重组Sp17蛋白和制备了Sp17单克隆抗体的基础上［7］，制备了Sp17多克隆抗体并建立了血清Sp17双抗夹心ELISA检测方法，并对该法的临床应用价值进行了初步的研究，为探索血清Sp17水平与卵巢癌等肿瘤的预后、迁移之间的关系以及血清Sp17水平是否能够成为卵巢癌早期诊断的一项新的指标提供依据。

1  材料和方法

　　1.1  材  料

　　1.1.1  实验动物及组织标本

　　健康雄性成年新西兰兔2只，南京军区南京总医院实验动物中心提供。前列腺癌患者去势治疗手术切除的睾丸组织。

　　1.1.2  试剂和主要仪器

　　原核重组Sp17蛋白抗原(本实验室研制)。福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂(Sigma公司)，HRP羊抗兔IgG抗体(华美生物工程公司)，小牛血清白蛋白(BSA)、TMB(南京生兴生物公司)。96孔可拆酶标板(荷兰NUNC公司)，酶标仪ELX800(BIOTEK公司)。

　　1.1.3  血清样本

　　2005年12月至2006年4月南京军区南京总医院住院卵巢癌患者血清28份，女性健康献血员血清42份为正常对照组。

　　1.2  方  法

　　1.2.1  Sp17多克隆抗体制备［8］ 

　　以原核重组Sp17蛋白为抗原，采用皮内多点注射结合腹腔注射的方法，免疫无基础交叉抗体的雄性新西兰兔，获得免疫血清。盐析法对该免疫血清纯化，加入0.02% 叠氮钠分装, -70℃保存待用。

　　1.2.2  免疫组化法鉴定Sp17多克隆抗体与天然Sp17的反应性  　　取前列腺癌患者去势治疗手术切除的睾丸组织制备石蜡切片，以Sp17 多克隆抗体（1∶2 000稀释）为一抗，进行免疫组化检测。

　　1.2.3  双抗夹心ELISA操作流程

　　用鼠抗Sp17单克隆抗体包被ELISA板，依次加入重组表达的Sp17标准品或待测血清、兔抗Sp17多克隆抗体和HRP-羊抗兔IgG抗体，TMB避光显色，终止反应后在450 nm波长处读取实验各孔D值。以标准品浓度为横坐标，相应D值为纵坐标，以不同稀释度标准品D值减去零孔D值绘制标准曲线。

　　1.2.4  兔抗Sp17多克隆抗体工作浓度及HRP-羊抗兔IgG抗体稀释度

　　以一定浓度的鼠抗Sp17单抗包被ELISA板,依次加入定量的标准品及倍比稀释的兔抗Sp17多克隆抗体(1∶500～1∶8 000)和HRP-羊抗兔IgG抗体 (1∶1 000～1∶16 000), 进行ELISA棋盘滴定，确定兔抗Sp17多克隆抗体和HRP-羊抗兔IgG抗体的工作浓度。

　　1.2.5  包被单克隆抗体工作浓度的选择

　　以倍比稀释的Sp17单克隆抗体(0.1～1.6 μg/ml)包被酶标板，在上述棋盘滴定确定的多抗和酶标抗体的工作浓度下确定包被单抗的工作浓度。

　　1.2.6  精确度及准确度试验

　　批内试验及批间试验测定本检测系统精确度。在已知Sp17浓度的血清中加入不同浓度的Sp17标准液，检测回收率，以确定系统的准确度。

　　2  结  果

　　2.1兔抗Sp17多克隆抗体与天然Sp17反应性的免疫组化结果     　　免疫组化结果显示，兔抗Sp17多克隆抗体能与正常人睾丸中精母细胞、精细胞和成熟精子发生特异性结合反应（图1A），但一抗阴性对照（未免疫血清）未与睾丸组织发生结合反应（图1B）。

　　2.2  试剂工作浓度的确定

    棋盘滴定选择D（450 nm）值在1.0左右的抗体稀释度作为Sp17多克隆抗体及酶联抗体的工作浓度，确定Sp17多克隆抗体稀释度为1∶2 000，HRP-羊抗兔IgG抗体稀释度为1∶4 000。在Sp17单抗包被浓度确定实验中，发现不同包被单抗浓度的D（450 nm）值之间没有明显差异，确定包被酶标板的鼠抗Sp17单抗的工作浓度为0.4 μg/ml。

　　2.3  精确度

    取3份浓度不同的标本于同一批内各测8次，其批内CV范围为7.59%～8.26%，平均批内CV为7.89%。在5个不同检测日分别对3份标本各测定5次，其批间CV范围为12.98%～14.42%，平均批间CV为13.56%。

　　2.4  准确度

    在已知Sp17浓度的血清中加入不同浓度的Sp17标准液，用建立的ELISA方法测得的回收率分别为82%和89%，平均为85.5%。

　　2.5  标准曲线及检测灵敏度

    应用建立的ELISA方法，以倍比稀释Sp17蛋白(5.0～100 ng/ml)为系列标准管，得到双夹心ELISA法测定Sp17的标准曲线(图2)。结果显示，在5.0～100 ng/ml范围内呈线性关系，直线回归方程为：Y=0.0067X+0.0164，回归系数r=0.991 4。以零标准管平均D（450nm）±2 s计算，Sp17蛋白的检测限约为6.0 ng/ml。

2.6  正常人及卵巢癌患者血清中Sp17的检测结果

    卵巢癌患者与正常人血清Sp17含量有显著差别（P<0.01），28份卵巢癌患者血清中，以大于36.0 ng/ml为阳性标准，则有11份血清标本为阳性，阳性率为39.3% (表1)。表1  正常人及卵巢癌患者血清中Sp17的检测 （略）    　　3  讨  论

    在正常人睾丸中，精母细胞,早期、晚期精细胞以及成熟精子表达Sp17，而精原细胞、支持细胞和间质细胞则阴性，人体其他正常组织极少表达Sp17。Sp17在一些肿瘤细胞中的异常表达的调控机制和在肿瘤的发生发展中的作用还不是十分清楚。Dong 等［9］研究发现在鳞状上皮细胞癌小鼠模型中，转移阶段的肿瘤细胞中可检测到Sp17 mRNA表达，而浸润阶段检测不到，认为Sp17可能在肿瘤细胞的迁移中起重要作用。Straughn等［10］对卵巢癌组织进行RTPCR、Northern blot和Western blot分析，Sp17阳性率分别为83%，68%，42%，用Northern blot分析正常组织包括正常卵巢都未见Sp17的表达。但有关检测体液中Sp17含量的方法以及正常人和卵巢癌患者血清中Sp17蛋白水平国内外还未见报道。我们认为，由于并不是所有的卵巢癌组织都表达Sp17，那么释放到血液中的Sp17以及其量的变化可能与卵巢癌的预后、迁移存在一定的关系，并可能成为卵巢癌早期诊断的一项新的指标。

    我们以本实验室原核表达的重组Sp17蛋白免疫家兔，制备了Sp17多克隆抗体，免疫组化分析表明，兔抗Sp17多克隆抗体与人精子以及正常人睾丸组织中精母细胞、精细胞和成熟精子发生了特异性结合反应，未免疫兔血清则呈阴性反应。说明该Sp17多克隆抗体具有能与天然Sp17抗原结合的高度特异性，为建立Sp17双抗夹心ELISA检测方法提供了第二种动物来源的特异性的抗体。我们采用本实验室制备并纯化的Sp17单克隆为包被抗体，经棋盘滴定确定各工作液的最佳浓度，建立了定量检测Sp17的双抗夹心ELISA系统。本方法精确度批内平均CV为7.89%，批间平均CV为13.56%；加入抗原的回收率平均为85.5%；ELISA标准曲线在5.0～100 ng/ml范围内呈直线关系，回归系数r=0.991 4，检测的下限为6.0 ng/ml。本测定方法有较高的灵敏度、特异性和稳定性，可以满足科研和临床研究的需要。

    我们的研究结果显示，卵巢癌患者与正常人血清Sp17含量有显著差别，正常人血清中存在少量Sp17蛋白，而卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高者占39.3%，与Straughn等对卵巢癌组织进行Western印迹分析42%的阳性率相符，提示血清Sp17的测定可以作为卵巢癌一项新的诊断指标。

    为了进一步提高Sp17的ELISA方法的可靠性，尚需对Sp17单克隆和多克隆抗体进行进一步纯化，并直接对兔抗Sp17多克隆抗体进行标记以优化实验步骤。本研究的病例尚少，有待于下一步进行大样本的血清Sp17的检测和分析，并且与卵巢癌其他肿瘤标志物如CA125进行联合检测，以期为卵巢癌的早期诊断和判断卵巢癌的迁移、预后和疗效提供依据。

【参考文献】  　　　［1］Grizzi F, ChirivaInternati M, Franceschini F, et al. Immunolocalization of sperm protein 17 in human testis and ejaculated spermatozoa［J］. J Histochem Cytochem, 2003, 51(9): 1245-1248.

　　［2］ChirivaInternati M, Grizzi F, Franceschini B, et al. Is sperm protein 17 a useful target for tumor immunotherapy［J］? Blood, 2003, 102(6):2308-2309.

　　［3］Gupta G, Sharma R, Chattopadhyay TK, et al. Clinical significance of sperm protein 17 expression and immunogenicity in esophageal cance［J］. Int J Cancer, 2007, 120(8):1739-1747.

［4］Grizzi F, ChirivaInternati M, Franceschini F, et al. Immunolocalization of sperm protein 17 in human testis and ejaculated spermatozoa［J］. J Histochem Cytochem, 2003, 51(9): 1245-1248.

　　［5］Zhang Y, Wang Z, Robinson WR, et al. Combined real time PCR and immunohistochemical evaluation of sperm protein 17 as a cancertestis antigen［J］. Eur J Haematol, 2004, 73:280-284.

　　［6］李芳秋, 杨爱龙, 黄文斌,等. 精子蛋白17在上皮性卵巢癌中的异常表达［J］. 中华肿瘤防治杂志, 2006,13 (15):1174-1177.

　　［7］李芳秋, 杨爱龙, 缪家文,等. 人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定［J］.细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(5):638-640.

　　［8］王廷华, 李官成, XinFu Zhou. 抗体理论与技术［M］. 北京：科学出版社, 2005：80-90.

　　［9］Dong G, Loukinova E, Smith CW, et al. Genes differentially expressed with malignant transformation and metastatic tumor progression of murine squamous cell carcinoma［J］. J Cell Biochem Suppl, 1997, 67(28/29):90-100.

　　［10］Straughn JM Jr, Shaw DR, Guerrero A, et al. Expression of sperm protein 17 (Sp17) in ovarian cancer［J］. Int J Cancer, 2004, 108(6):805-811.

［基金项目］ 江苏省“六大人才高峰”基金资助项目（2005A2）