乳腺癌组织中蛋白激酶CβΙ与周期蛋白D1的表达

作者:李建萍,左克强

作者单位：湘南学院基础医学课部生化教研室，湖南 郴州 423000

     【摘要】  　　目的： 观察蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）βΙ与周期蛋白D1（cyclin D1）在乳腺癌组织中的表达状况，探讨癌细胞信息传递的分子生物学机制。方法： 应用半定量RTPCR检测31例乳腺癌组织与12例癌旁正常乳腺组织中PKCβΙ mRNA表达；应用Western blot和免疫组化法检测以上组织中PKCβΙ蛋白与cyclin D1表达。 结果： 乳腺癌组织中PKCβΙ mRNA与蛋白表达均高于癌旁正常乳腺组织（P<0.01）；癌组织cyclin D1表达阳性率高于癌旁正常乳腺组织（P<0.05）。 结论： 乳腺癌组织中存在PKCβΙ同工酶过度表达，它可能介导乳腺癌细胞分化的信号转导过程。cyclin D1与细胞恶性增生密切相关。

【关键词】  乳腺癌　蛋白激酶C－βΙ　周期蛋白D1　表达

　　　Expression of protein kinase CβΙ and cyclin D1 in human breast cancer

　　LI Jianping，   ZUO Keqiang    　　Department of Biochemistry，Basic Medical College， Xiangnan University，Chenzhou Hunan 423000，China

　　［Abstract］  Objective: To investigate the expression  of protein kinase C(PKC) isoenzymes and cyclin D1 in breast cancer. Methods： The expression of PKCβΙ was detected by semiquantitative RTPCR and Western blotting and Immunochemical method in 31 cases of breast cancer and 12 cases of normal tissues.  Results： PKCβΙ mRNA and protein and cyclin D1 were markedly increased in cancer tissues compared to normal tissues (P<0.01， P<0.05). Conclusion： Overexpression of PKCβΙ played an important role in regulating cellular proliferation of breast cancer. cyclin D1 was found to be closely associated with cell malignant hyperplasia .

　　［Key words］  breast cancer； protein kinase CβΙ； cyclin D1； expression

    细胞增殖呈周期性变化受到精密的调控，周期蛋白（cyclin）和周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase， CDKs）是细胞周期的正调节因子，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）作为信号分子，是一类依赖于钙、磷脂和二酰甘油激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是细胞生长调控信息通路的重要组成成分，参与细胞多种生理功能的信号转导，如转录调节、免疫介导、细胞生长、分化、增殖、癌变及细胞凋亡过程。

    迄今为止已从不同种属的器官分离纯化出12种PKC同工酶，每种同工酶有特异的底物及激活剂，并可能介导了不同的信号传递，PKC各种同工酶的功能如今还在争论和研究中［1］。为探讨PKCβΙ与cyclin D1在乳腺癌细胞增殖、分化及信息传递的分子生物学机制，我们应用半定量RTPCR、Western blot和免疫组化法研究cyclin D1与PKCβΙ同工酶在乳腺癌组织中的表达。

　　1  材料与方法

　　1.1  组织标本

    收集河北医科大学附属第四医院外科2005年3月～2005年5月确诊原发乳腺癌而未做放疗和化疗的患者癌组织标本31例，年龄30～50岁，取距癌组织边缘5 cm以上的癌旁组织、经病理证实无肿瘤细胞浸润、无明显炎症病变乳腺正常组织标本12例，取一部分立即经液氮冷冻后，保存于-80 ℃超低温冰箱内。另一部分用10％甲醛固定，免疫组化备用。

　　1.2  主要试剂与仪器

    反转录试剂盒（Promega公司），Western blot 用的PKCβΙ兔抗人多克隆抗体（Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶标记的二抗和DAB试剂盒（北京中山生物技术有限公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，华美生物公司），考马斯亮蓝检测试剂盒（南京建成生物工程所）， cyclin D1 鼠抗人单克隆抗体、克隆系为4C5，单克隆抗体及免疫组化试剂盒（美国ZYMED公司）。-80℃超低温冰箱和低温高速离心机（美国Thermo Forma公司），PCR仪（德国Eppendorf公司），凝胶成像分析仪（法国Vllber Lourma公司）。

　1.3  RTPCR半定量检测PKCβΙ mRNA表达

    取乳腺癌或癌旁正常乳腺组织100 mg，剪碎后加1 ml Trizol置玻璃匀浆器内，用液氮匀浆10 min，按照Trizol试剂说明程序提取细胞总 RNA， 取1 μg RNA经反转录酶在下列条件下合成cDNA：25℃ 5 min，40℃ 60 min，75℃ 15 min。然后用该cDNA作为模板进行PCR反应。PKCβΙ上游引物：5′CTT TGG CAT GTG TAA AGA GAA TAT CTG GGA3′；下游引物：5′GTC GAA GTT GGA GGT GTC TCG CTT GTC TCT3′，扩增片断长度为442 bp，内参照用GAPDH上游引物：5′CCA ATA TGA TTC CAC CCA TG3′，下游引物：5′AGG TCC ACC ACT GAC ACG TT3′，扩增片断长度为594 bp，由北京赛百胜基因技术公司合成。扩增条件如下：94℃ 2 min，94℃ 40 s、55℃ 60 s、72℃ 40 s进行30个循环，72℃延伸10 min终止反应。将PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像分析仪中摄影，采用1 D图像分析系统（BIOPROFIL Bio1 D Windows Application V10.02）测光密度值，用PKCβΙ与GAPDH光密度的比值代表PKCβΙ的相对含量。

　　1.4  Western blot检测PKCβΙ蛋白表达

    从-80℃冰箱中取出保存的组织100 mg，剪碎后加入细胞裂解液（50 mmol/L TrisHCL pH7.4，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L Na2EDTA，0.5% NP40，0.5% TritonX100，0.1% SDS、临用时现加蛋白酶抑制剂：1 mmol/L PMSF、1 mmol/L Leupeptin，1 mmol/L Aprotinin，1 mmol/L Pepstain），置玻璃匀浆器中，用液氮匀浆10 min，4 ℃裂解1 h， 4 ℃ 12 000 r/min离心60 min，吸取上清液，用考马斯亮蓝检测蛋白浓度。取100 μg总蛋白进行8％ SDSPAGE电泳，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，TBST液漂洗3次，加入PKCβΙ多抗（1∶600），4 ℃孵育过夜，TBST液漂洗3次，加辣根过氧化酶标记的相应二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h，TBST液再次漂洗后，DAB显色，凝胶成像分析仪中摄影，采用1 D图像分析系统扫描体积后，用PKCβΙ蛋白与内参照βactin的比值代表PKCβΙ蛋白的相对含量。

　　1.5  免疫组化检测cyclin D1蛋白表达

    采用免疫组化ZYMEDpic TureTM二步法，标本常规石蜡包埋，制成连续4 μm切片2张，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3％ H2O2消除内源性过氧化物酶活性，高温抗原修复，加入一抗为小鼠抗人cyclin D1单克隆抗体，应用浓度为1∶100，湿盒内4℃孵育过夜，滴加polymer Help试剂，加poly peroxidaseantimouse/rabbit IgG试剂，DAB显色，苏木精复染，常规脱水封片。光镜下观察结果，细胞核有棕黄色颗粒着色为cyclin D1表达阳性反应，细胞无棕黄色或背景一致的浅棕黄色为阴性。随机观察10个高倍视野记数，每个视野记数100个细胞，根据阳性细胞数所占比例判断结果。

　　1.6  统计学处理

    采用SPSS10.0统计软件进行分析。半定量RTPCR和Western blot结果用均数±标准差（±s）表示，进行t检验。免疫组化结果用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2  结  果

　　2.1  乳腺癌与癌旁组织PKCβΙ mRNA表达的比较

    乳腺癌组织中PKCβΙ mRNA表达水平高于癌旁正常乳腺组织，差异有统计学意义（t=5.017，P<0.01），见表1，图1。表1  乳腺癌及癌旁组织PKCβΙ mRNA与蛋白表达的比较（略）

　　2.2  乳腺癌与癌旁组织PKCβΙ蛋白表达的比较

    乳腺癌组织中PKCβΙ蛋白表达高于癌旁正常乳腺组织，差异有统计学意义（t=3.763，P<0.01），见1，图2。    　　2.3  cyclin D1蛋白表达结果

cyclin D1蛋白阳性物定位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状。12例癌旁正常乳腺组织中，仅2例（16.67%）cyclin D1蛋白阳性。31例乳腺癌组织中24例（77.42%）cyclin D1蛋白表达阳性。乳腺癌组织cyclin D1蛋白明显高于癌旁正常乳腺组织（χ2=13.375，P＜0.05）。

　　3  讨  论

    PKC同工酶是细胞磷脂酰肌醇信号转导途径的重要物质，根据其结构与相应激活剂的异同将其分为三类：cPKCs(classical PKC)由α，βΙ，βⅡ，γ组成；nPKCs(novel PKC)由δ，ε，η，θ，μ组成；aPKCs(atypical PKC)由ζ，λ，ι组成。某些癌基因的表达会明显改变PKC同工酶的含量及在细胞内的分布，研究证明PKC是促癌物质PMA（phorbol，12myristate13acetate，即佛波醇12豆蔻酰13乙酸）的细胞内受体，PMA可直接激活PKC，促进细胞全部或部分依赖PKC信号通路，跨越其遗传学及生化学改变阶段，进入形态改变期，触发肿瘤的形成［2］。可见PKC在细胞恶性变过程中起重要作用。         　　对于不同类型的癌组织，各种PKC同工酶的活性不同所起的调控作用各异，PKCα蛋白表达增加与巨噬细胞的诱导分化平行，PKCβ蛋白水平与细胞增殖相关。在小细胞肺癌中PKCα，β，δ，ε和η表达明显增加，在人急性白血病细胞中PKCα，β，γ，μ和ζ表达异常增高［3］。肺癌组织中存在PKCβΙ基因过度表达［4］。本研究采用RTPCR和Western blot方法检测了PKCβΙ mRNA与蛋白表达状况，试图从转录和翻译水平揭示其在乳腺癌变中的作用，我们观察到：乳腺癌组织中PKCβΙ mRNA和蛋白表达水平都高于癌旁正常乳腺组织（P<0.01），呈现PKCβΙ基因过度表达，并且两种方法检测结果趋势一致，说明在乳腺上皮癌变过程中，随着PKCβΙ基因转录活性的增高，蛋白质翻译水平自然会增高。由此证实，PKCβΙ介导的信号转导及过度激活与乳腺癌的发生、发展有密切关系。关于PKCβΙ介导的信号转导及过度激活与肿瘤发生有关的机制，通常认为：肿瘤的发生要经过起动阶段、促进阶段和发展阶段。在这些环节中都有PKC参与的证据［5］：质粒转染实验证明PKC在肿瘤起动阶段有作用；PKCβΙ过表达的人胚肺成纤维细胞2BS具有典型的恶性表型，并可使原癌基因Csis、Haras表达增加，而抑癌基因Rb（retinoblastoma，Rb）表达下降。柳惠图等［6］认为：PKC的激活可能是癌基因Haras转化细胞必不可少的环节之一，而且PKC过表达使细胞对癌基因Haras转化更敏感。程玺等［7］证实：人非小细胞肺癌中PKCβΙ表达阳性率增加的同时伴有其细胞凋亡水平的降低，因而提示PKCβΙ可能介导了抑制癌细胞凋亡的信号转导。

    乳腺癌致病的分子机制至今仍不清楚。有研究表明肿瘤是一种细胞周期病，是由于一种或多种细胞周期正、负向调节因子功能失常所造成［8］。细胞周期正向调控物有cyclin A～H，其中cyclin D1和cyclin E分别能与CDK4、CDK2结合形成CDK4/cyclin D1，CDK2/cyclin E 有活性的激酶复合物，使抑癌基因Rb表达的RB蛋白磷酸化失去活性，因此细胞迅速进入G1期分裂繁殖。本研究中，乳腺癌组织细胞周期蛋白cyclin D1表达阳性率高于癌旁正常组织（P＜0.05），此结果与cyclin D1在其他肿瘤中的表达状况一致［9］。并且显示出，乳腺腺体从正常进展为癌的过程中，随着组织异型性程度的加重，cyclin D1表达水平呈明显上升趋势，说明cyclin D1基因在细胞周期中行使促进细胞增殖的功能。cyclin D1基因的异常表达是乳腺癌变过程中的早期事件。

    肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤导致的极其复杂过程。本研究表明，乳腺癌组织中PKCβΙ同工酶mRNA及蛋白表达显著增加，PKCβΙ过度激活可能介导了乳腺上皮细胞癌变的信号转导过程。并且cyclin D1与细胞恶性增生密切相关。

致谢：本实验大部分工作在河北医科大学药理教研室完成，感谢许彦芳教授、张海林教授在本研究过程中给予的指导与帮助。）

【参考文献】  　　［1］Mellar H，Parker PJ.The extended protein kinase C superfamily［J］. Biochem J，1998，332(2)：281-292.

　　［2］Nishizuka Y. Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses［J］. FASEB J，1995，9（7）：484-496.

　　［3］Akkaraju GR，Basu A. Overexpression of protein kinase Cbeta attenuates caspase activation and tumor necrosis factoralphainduced cell death［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，279（1）：103-107 .

　　［4］周清华，刘伦旭，李 潞，等.PKC基因在人肺癌中的转录表达［J］.中国肺癌杂志，2000，3(5)：351-354.

　　［5］Barr LF，Campbell SE，Baylin SB. Protein Kinase Cbeta 2 inhibits cycling and decteases CmyCinduced apoptosis in small cell lung cancer cells［J］. Cell Growth Differ，1977，8(4)：381-392.

　　［6］柳惠图，冯 怡，李 娜. PMA对人肝癌细胞中Haras基因启动子活性的影响及与PKC活性的相关性［J］.自然科学进展，2002，12（7）：754-758.

　　［7］程 玺，周清华，王 允，等.人非小细胞肺癌中蛋白激酶CβΙ的表达及细胞凋亡与预后关系的研究［J］.中国肺癌杂志，2004，7（5）：404-408.

　　［8］Bartek J，Lukas J，Bartkova J.Perspective：defects in cell cyclin control and cancer［J］. J Pathol，1999，187(1)：95-99.

　　［9］江捍平，王大平，肖建德，等.骨软骨瘤和骨恶性肿瘤cyclin D1与CDK4的表达及意义［J］.中国现代医学杂志，2004，14（11）：31-34.