秦巴山区孕妇人巨细胞病毒宫内感染与UL54、UL97基因突变的关系

作者：盛秋,李芬,于学文,李琦

 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院妇幼保健中心，陕西西安 710061；北京大学首钢医院妇产科，北京 100041        【摘要】  目的 探讨秦巴山区孕妇妊娠期人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染与HCMV UL54、UL97基因突变的关系。方法 采用PCR方法检测228对孕妇血清和新生儿脐血血清中的HCMV DNA，对HCMV DNA阳性者采用限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法检测HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子是否发生突变。结果 ①228例孕妇血清中HCMV DNA阳性者19例，阳性率为8.33%；新生儿脐血血清中HCMV DNA阳性8例，阳性率为3.51%。在19例HCMV DNA阳性孕妇中，其配对脐血阳性7例，HCMV宫内传播率为36.84%。②HCMV DNA阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中均未发现HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子发生突变。结论 秦巴山区HCMV宫内感染的发生率较高，其发生与HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子突变无相关性，但不排除存在其他位点突变或其他形式基因异常导致病毒致病性改变的可能性。

    【关键词】  人巨细胞病毒；HCMV宫内感染；基因突变

    人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是人类先天性感染的常见原因之一，在人群中感染广泛。孕妇感染HCMV后可导致流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓、新生儿先天畸形、新生儿并发症及远期后遗症等。本课题既往对秦巴山区的研究调查表明，该地区孕妇孕期HCMV感染率为19.59%，明显高于国内外文献的报道[1]。目前对HCMV导致胎儿损害的机制尚不能做出完善的解释。近年来，从分子水平研究HCMV的发病机制是倍受关注的热点。本研究在国内首次采用分子生物学的方法探讨秦巴山区孕妇妊娠期宫内HCMV感染与基因突变的关系，以期揭示其发病机理，采取有效的防治措施，最终达到提高出生人口素质的目的。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象

　　选取2002年5月至2005年7月秦巴山区2县4乡住院分娩的单胎孕妇228 例作为研究对象。孕妇年龄20-36(25.83±2.23)岁，孕周35-41周，其中自然分娩189例，剖宫产39例(均为产科因素)。分娩时成对采集孕妇肘静脉血及新生儿脐带血(脐血在胎儿娩出后未断脐时于脐带胎儿端抽取)，每份样本5mL，分离血清后于-70℃保存。所有孕妇均无妊娠合并症，无风疹病毒、弓形虫及单纯疱疹病毒活动性感染，且排除家族性遗传性疾病。

　　1.2  方法

　　1.2.1  基因片段的PCR扩增

　　盐析法提取HCMVDNA。UL54基因的扩增及检测：所用引物为5χCGCCACCAAGGTGTATAT 3χ和5χAGTGGTTGGGCAGGATAA 3χ，反应体系为25μL。体系中含有10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP混合液0.5μL，MgCl2(25mmol/L)1.5μL，引物混合液0.5μL，模板2μL，TaqDNA聚合酶(u/μL)1μL，无菌去离子水17μL，无菌液体石蜡20μL。循环条件为：94.5℃ 50s，55℃ 45s，72℃ 50s，共35个循环，最后72℃ 7min。20g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。UL97的扩增及检测：所用引物为 5χCGGTCTGGACGAGGTGCGCAT3χ和5χ AATGAGCAGACAGGCGTCGAAGCAGTGCGTGAGCTTGAAGTTCTT 3χ。反应体系同上。循环条件为：94.5℃ 1min，51℃ 45s，72℃ 50s，共40个循环，最后72℃ 7min。20g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

　　1.2.2  PCRRFLP检测基因突变

　　 ①UL54基因501密码子的检测：扩增后的UL54片断用限制性内切酶AluⅠ在37℃水浴箱2h进行酶切，3g/L琼脂糖凝胶检测酶切结果。②UL97基因594、594密码子的检测：扩增后的UL97片断分别用限制性内切酶HhaⅠ在37℃水浴箱2h进行酶切及TaqⅠ在65℃水浴2h进行酶切，酶切产物用100g/L聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。

　　1.3  统计学处理

　　采用SPSS11.0软件对数据进行处理，计数资料采用Fisher精确概率法进行统计学检验，显著性标准为α=0.05。

　　2  结 果

　　2.1  孕妇HCMV宫内感染情况  　　228例配对血中，孕妇血清HCMV DNA(＋)19例，阳性率为8.33%；新生儿脐血血清HCMV DNA(＋)8例，阳性率为3.51%。在19例HCMV DNA(＋)孕妇中,其配对脐血阳性7 例， HCMV宫内传播率为36.84%；209例HCMV DNA(-)的孕妇血清中脐血阳性1例，阳性率为0.48%。可见孕期HCMV活动性感染与胎儿宫内感染有显著相关性(χ2＝55.11，P<0.005)。

　　2.2  孕妇血清及新生儿脐血中HCMV DNA的检测

　　经PCR扩增后得到UL54的扩增片段，产物为核苷酸2075-2460，长度为386bp，其中包含密码子501(图1)。

　　经PCR扩增后得到UL97的扩增片段,产物为核苷酸1713-1830，长度为118bp,其中包含密码子594和595(图2)。

　　2.3.1  UL54密码子501突变

　　在HCMV野生型病毒株的上述UL 54片段扩增产物中包含一个AluⅠ识别位点，被AluⅠ消化后产生283bp和103bp两个片段；在HCMV突变病毒株中核苷酸2160处的碱基T→C，密码子501发生改变，AluⅠ酶切后可产生283bp、85bp和18bp三个片段。本研究HCMV DNA阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中，上述UL54扩增片断产物经AluⅠ酶切后，只见到283bp和103bp两个片段，提示病毒株密码子501未发生突变(图3)。

　　2.3.2  UL97密码子594和595突变

　　在HCMV野生型病毒株的上述UL 97扩增片段产物中包含4个HhaⅠ识别的位点，被HhaⅠ消化后产生50bp、38bp、18bp和12bp四个片段；在突变株中密码子594C→T，减少一个HhaⅠ识别位点，HhaⅠ酶切后产生62bp、38bp和18bp三个片段。本研究HCMV DNA阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中，在上述UL 97扩增片断经HhaⅠ酶切后，只见到50bp和38bp两个片段(18bp和12bp由于片段太小跑出胶)，提示病毒株密码子594未发生突变(图4)。

　　在HCMV野生型病毒株的上述UL 97扩增片段产物中包含1个TaqⅠ识别位点，被TaqⅠ消化后产生99bp和19bp两个片段；突变株密码子595 T→C，增加了一个TaqⅠ识别位点，TaqⅠ酶切后产生71bp、28bp和19bp三个片段。本研究HCMV DNA阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中，上述UL 97扩增片断经TaqⅠ酶切后，只见到99bp(19bp由于片段太小跑出胶)，提示病毒株密码子595未发生突变(图5)。

　　3  讨 论

　　HCMV在自然界中广泛存在，人群中存在高感染率。在我国孕妇HCMV的感染率为70%-80%[23]。HCMV可通过宫内传播或产道沾染的途径感染胎儿，大多数婴儿感染HCMV后无明显症状，但在少数或有免疫抑制的个体可引起严重疾病。本研究中在HCMV活动性感染孕妇中，其宫内感染率明显高于非感染者(P<0.005)，提示孕期HCMV活动性感染与宫内感染有显著性关联，这支持婴儿HCMV感染主要由母亲传播而来的观点。孕妇HCMV感染因地理环境及不同经济阶层差异较大。秦巴山区为贫困山区，同时也是弱智高发区，该地区家庭年收入低，家庭生活环境及自我保健意识均较差，这也是影响该地区儿童智力发育低下的重要因素[4]。孕期HCMV宫内感染对胎儿产生的影响目前已经被广泛证实，但迄今为止对于孕期HCMV宫内感染的机制仍不是很清楚。孕期HCMV感染后，病毒在体内的活动状态对胎儿的影响差别较大。大部分孕妇感染HCMV后可呈现潜伏性感染，即病毒的非复制性感染，其对胎儿的影响很小，一般不发生先天性感染；而活动性感染对胎儿造成的危害较大，其宫内垂直传播率较高[5]。本研究结果也支持这一理论。由此可见，HCMV宫内感染与病毒在体内的活动状态有关。HCMV病毒株的基因结构存在变异，其临床分离株有明显的片断长度多态性(RFLP)差异[6]。研究发现HCMV UL54基因(DNA聚合酶基因)及U97基因在病毒复制过程中起重要作用[78]；进一步研究发现，HCMV UL54、U97基因突变株不但表现出对药物(GCV)的耐药性，同时突变病毒株在组织培养实验中比标准株复制更快，在组织中更易释放[910]。由此推断感染不同病毒株时病毒在体内得活动状态存在差异。那么究竟是何种原因导致HCMV宫内感染的发生，HCMV在体内的活动状态是否与基因结构改变导致致病力改变有关，目前国内外尚无相关报道。本课题既往研究提示该地区孕妇HCMV宫内感染与多种免疫因素有关[11]。本研究在此基础上首次采用分子生物学方法对该地区孕期HCMV宫内感染进行分子水平的探讨。PCRRFLP分析结果显示，孕期HCMV宫内活动性感染者中未发现UL54 501密码子及UL97 594和595密码子的突变，但不排除其他位点的突变的可能。本次研究由于该地区样品采集条件受限，例数较少，仅进行了UL54和UL97基因3个密码子突变的检测，不能排除其他形式的基因异常导致病毒致病性改变存在的可能性。近年来有报道HCMV宫内感染与多种基因分子水平的改变有关系，可能为多种基因协同作用的结果[1213]。今后可在此研究的基础上，开展更深层次的研究，以揭示HCMV宫内感染的发生机制，最终达到提高秦巴山区出生人口素质的目的。

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