人类宫颈癌中白细胞介素6与髓样细胞白血病1表达的相关性及临床意义

作者：马瑶,吴静,赵秀敏

 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院妇产科，陕西西安 710004           【摘要】  目的 研究白细胞介素6(IL6)、髓样细胞白血病1(MCL1)蛋白及MCL1mRNA在宫颈癌、癌前病变及正常宫颈组织中的表达情况及其相关性。方法 采用免疫组化法检测30例宫颈鳞癌、10例宫颈上皮内瘤变(CIN)及10例正常宫颈组织中IL6和MCL1蛋白表达情况，采用逆转录PCR法检测组织中MCL1 mRNA的表达情况。结果 IL6和MCL1蛋白在宫颈癌组织中的表达高于正常宫颈组织及CIN组织(P<0.01)，且IL6和MCL1蛋白的表达呈正相关性(r=0.566，P<0.01)；MCL1蛋白与MCL1mRNA表达呈正相关性(r=0.772，P<0.01)。结论 IL6和MCL1的表达在宫颈癌的发生、发展过程中起着共同调节作用，这一发现有助于对早期癌前病变的筛查，并为宫颈癌的治疗提供了一个细胞因子靶点。

    【关键词】  白细胞介素6；髓样细胞白血病1；宫颈癌；凋亡

　　The correlation and clinical significance of interleukin6 and　myeloid cell leukelia1 expression in human cervical cancer

　　Ma Yao, Wu Jing, Zhao Xiumin

　　(Department of Obstetrics & Gynecology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the expression and correlation of interleukin6 (IL6), myeloid cell leukelia1 (MCL1) protein and MCL1mRNA in cervical cancer, cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and normal cervix. Methods  Immunohistochemistry was used to detect the expression of IL6 and MCL1 protein in 30 samples of cervical squamous cell carcinoma, 10 samples of CIN and 10 samples of normal cervix, and RTPCR was used to detect the expression of MCL1mRNA. Results  The protein levels of IL6 and MCL1 were significantly higher in cervical cancer tissues than in normal cervix and CIN tissues (P<0.01), and MCL1 protein expression was positively correlated to IL6 protein expression (r=0.566, P<0.01); MCL1mRNA expression was positively correlated to MCL1 protein expression (r=0.772, P<0.01). Conclusion  IL6 and MCL1 expression probably play an important regulating role in the pathogenesis and development of cervical cancer. It is conducive to screening the precancerosis and providing a cell factor target for the treatment of cervical cancer.

　　KEY WORDS: interleukin6; myeloid cell leukelia1; cervical cancer; apoptosis

　　白细胞介素6(interleukin6)是具有多种生物活性的多能细胞因子，同时也是女性生殖道感染中重要的促炎症因子，其对宫颈癌细胞的增殖和血管生成有重要影响[1]。体外研究表明，IL6可能还存在一定的抗凋亡作用，即通过改变BCL2家族蛋白的水平来调节凋亡[2]。髓样细胞白血病1(myeloid cell leukelia1)在人类宫颈癌组织中的表达是BCL2家族抗凋亡蛋白中最丰富的[3]。目前国内关于宫颈癌细胞中IL6与MCL1的相关性尚未见报道。本研究通过测定宫颈癌及癌前病变患者宫颈组织中IL6和MCL1蛋白及MCL1mRNA水平，探讨IL6在宫颈癌发生发展过程中的作用及与细胞凋亡的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  研究对象  选择2005年10月至2006年3月在西安交通大学医学院第二附属医院手术治疗的宫颈鳞癌患者30例，术前均无化疗、放疗及其他治疗史,不合并其他炎症性疾病。患者年龄为32-72岁，中位数年龄44岁。选择同期宫颈上皮内瘤变(CIN)及正常宫颈组织各10例作为对照。CIN患者年龄37-50岁，中位数年龄46.5岁；正常对照患者年龄29-53岁，中位数年龄47.5岁。所有病例均经病理检查确诊。所有标本取材两份，一份福尔马林固定行免疫组化分析，一份-80℃保存待测。

　　1.2  方法

　　1.2.1  免疫组化SABC法检测IL6和MCL1蛋白表达  10%(体积分数)甲醛溶液固定标本，石蜡包埋后制成7μm连续切片,采用免疫组化染色。鼠抗人IL6单克隆抗体购自德国AppliChem公司，鼠抗人MCL1单克隆抗体购自福建迈新生物技术开发公司，操作严格按说明书进行。以PBS代替一抗做阴性对照组,用已知阳性组织作阳性对照。    　　结果判断：瘤细胞内出现棕黄色颗粒判断为阳性。运用灰度分析系统将阳性细胞染色强弱转化为灰度值，灰度值的大小与染色强弱成反比。

　　1.2.2  RTPCR法检测MCL1mRNA的表达  取-80℃保存标本，Trizol抽提总RNA，15μL逆转录体系中加入2.0μg总RNA，用cDNA合成试剂盒逆转录。 以获得的cDNA为模板，在25μL体系中行PCR。MCL1上游引物为5′CACGAGA CGGTCTTCCAAGGCATGCT3′，下游引物为5′CTAGGTTGC TAGGGTGCAACTCTAGA3′。内参对照βactin上游引物为5′AGCGGGAAATTGTGCATG3′，下游引物为5′CAGGGTACCTGGTGGTGC3′。PCR反应条件为95℃预变性3min，95℃变性30s→57.4℃退火30s→72℃延伸30s，共30个循环→72℃延长10min→4℃静置30min。    　　结果判断：电泳条带用BioRad凝胶成像系统拍照,并用Dophin1D凝胶分析软件分析。结果用特异基因和βactin电泳带吸光度的比值表示。

　　1.2.3  统计学处理  数据以±s表示，采用SPSS13.0软件进行一维方差分析、Pearson相关分析与显著性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  宫颈组织中IL6、MCL1蛋白的表达  宫颈癌组织中，IL6蛋白主要表达于癌细胞的细胞膜和(或)细胞质(图1A)，MCL1蛋白呈弥漫性、片状、灶状分布,主要表达于细胞质及细胞核(图1B)；CIN组织中IL6蛋白、MCL1蛋白均表达于邻近基底层的上皮细胞；正常宫颈组织中，IL6蛋白主要表达于上皮基底层细胞和上皮细胞的细胞膜和(或)细胞质；MCL1蛋白在正常鳞状上皮的基底层、棘细胞层呈散在性分布。IL6蛋白在鳞癌组的表达高于CIN组(F=8.68, P<0.01)及正常组(F=21.62, P<0.01)，CIN组与正常组间无显著性差异。MCL1蛋白在鳞癌组的表达高于CIN组(F=4.45, P<0.05)及正常组(F=22.98, P<0.01)，在CIN组中的表达高于正常组(F=7.19, P<0.05，表1)。

表1  宫颈癌、CIN和正常宫颈组织中IL6、MCL1蛋白表达的比较（略）

　　Table 1  Expression of IL6 and MCL1 protein in cervical cancer, CIN and normal cervix

　　CIN: cervical intraepithelial neoplasia; *P<0.01 vs. cervical cancer;△P<0.05 vs. cervical cancer; ▲P<0.05 vs. CIN

　　图1  IL6(A)、MCL1(B)在宫颈癌组织中的表达（略）

　　Fig.1 Expression of IL6(A) and MCL1(B) in cervical cancer (SABC×100)

　　2.2  宫颈组织中MCL1mRNA的表达  MCL1 mRNA在宫颈癌组中的表达(2.02±0.72)高于正常组(0.73±0.02)(F=20.34, P<0.01)，但宫颈癌与CIN组以及CIN与正常组间均无显著性差异(图2)。

　　2.3  IL6、MCL1蛋白表达与临床病理特征的关系  IL6蛋白的表达在宫颈癌病理学1级与2级和1级与3级之间有显著性差异(P<0.05)，而MCL1蛋白的表达仅在病理学1级与2级之间有显著性差异(P<0.05)。IL6和MCL1蛋白的表达与患者的年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移及FIGO分期均无显著性差异(表2)。

　　2.4  宫颈组织中IL6与MCL1蛋白及MCL1蛋白与MCL1mRNA表达水平的相关性  直线相关分析发现，随着IL6蛋白水平的增高，MCL1蛋白水平也逐渐增高，呈正相关 (r=0.566, P<0.01，图3)。随着MCL1蛋白表达灰度值的增高，MCL1 mRNA/βactin电泳吸光度比值逐渐下降，呈负相关(r=-0.772, P<0.01)，表示MCL1蛋白与MCL1 mRNA的表达水平成正相关(MCL1蛋白水平与灰度值的大小成反比，而MCL1mRNA水平与吸光度的比值成正比)。

　　图2  RTPCR检测MCL1及βactin mRNA的表达（略）

　　Fig.2 Expression of MCL1 and βactin mRNA by RTPCR

　　1, 4, 5, 6, 7, 9, 11: cervical cancer; 2, 3: CIN; 8, 10,12: normal cervix

　　表2  临床病理参数与宫颈癌组织中IL6及MCL1水平的比较（略）

　　Fig.2  Comparison of IL6 and MCL1 protein expression in different clinical and pathological parameters in cervical cancer

　　*P<0.05 vs. Grade 1

　　图3  IL6与MCL1蛋白表达相关性的散点图（略）

　　Fig.3 Correlation of IL6 and MCL1 protein expression

　　3  讨论    　　宫颈癌的发生大多归因于致瘤型人乳头瘤病毒(HPV)的感染，慢性抗原暴露可能引起一个连续性的循环，即诱导前炎症细胞因子及Th1细胞因子上调COX2，从而导致慢性Th2细胞因子的产生和前炎症反应中细胞免疫应答的下调，最终导致一个体液免疫应答占优势的环境[46]。然而，病毒的清除却依靠细胞免疫应答，这就造成肿瘤逃逸免疫监视而生长，并向其他组织部位转移及种植。因此，提示我们在慢性炎症向宫颈癌发展的过程中免疫逃逸可能是必要的诱发因素。    　　IL6是Th2细胞因子，是女性生殖道感染中重要的促炎症因子，可由多种淋巴细胞及非淋巴细胞产生。在感染后引发的宿主防御反应中，这些细胞通过自分泌及旁分泌机制产生IL6，在局部发挥作用[78]。目前已明确IL6在宫颈癌中可以通过促增殖和血管生成而表现为促生长的特性[1]。Tartour等[9]用PCR技术证实了正常宫颈、CIN和宫颈癌组织中都有IL6基因的表达。    　　MCL1基因是在研究人髓样白血病细胞系ML1用佛波酯诱导后，沿单核/巨噬细胞途径分化过程中，作为早期诱导基因被首次发现的。MCL1在防止细胞凋亡方面的作用首先在中国田鼠的卵巢细胞中得以证实。Crawford等[3，10]在对人类宫颈癌组织中所含的抗凋亡蛋白的分析中得出，MCL1是在人类宫颈癌组织中数量最丰富的抗凋亡蛋白，其水平显著高于其他BCL2家族成员，在57%的原发宫颈癌和75%的复发宫颈癌中表达阳性。    　　Kawano和Nakashima等[1112]的研究发现，IL6可作为凋亡诱导物或抑制剂，具体作用依赖于细胞类型。例如在临床多发性骨髓瘤组织和细胞系中都发现IL6能够诱导抗凋亡基因BCLxL和MCL1上调；在非吸烟女性的肺癌组织中发现IL6和MCL1呈现共表达，且它们的表达与是否存在HPV 16/18感染密切相关。Wei等[2]在6个宫颈癌组织中和5个独立的宫颈癌细胞系中分析IL6与BCL2家族蛋白水平，结果显示，无论是在临床的肿瘤标本中还是在体外细胞系中都观察到IL6和MCL1呈现高度的协同表达，但在正常宫颈组织中却并非如此。    　　本研究应用免疫组化法检测宫颈鳞癌组织中IL6与MCL1蛋白的表达，并与CIN及正常宫颈组织进行对照研究，发现3组中均有IL6与MCL1蛋白的表达。宫颈癌和CIN中IL6与MCL1蛋白的表达明显高于正常宫颈，且MCL1蛋白在宫颈癌中的表达高于CIN。这与Tartour、Crawford等[910]的研究结果相一致。提示IL6与MCL1蛋白的异常表达与CIN的进展及早期浸润癌的形成有关，为IL6促进宫颈癌的发生、发展提供了证据。MCL1蛋白在由正常组织向宫颈癌过渡中所表现出的显著递增表达，也进一步提示了其抗凋亡及促生长的作用。研究还发现，IL6蛋白在宫颈癌血管周围呈集中分布，这可能是因为肿瘤的低氧环境诱发IL6在血管内皮细胞的表达并促进肿瘤血管的生成，这与Wei等[1，1314]的研究相符。在IL6、MCL1蛋白表达与宫颈癌临床病理特征关系的研究中显示：IL6在低分化鳞癌中的表达明显高于高分化鳞癌，检测这一指标可能对预测转移潜能及评估预后具有一定的意义。    　　联合分析IL6与MCL1的表达，发现在宫颈癌、CIN及正常宫颈组织中,随着癌细胞、基底层细胞及上皮细胞中IL6水平的增高，MCL1水平逐渐增高,呈显著正相关，提示宫颈癌及CIN组织中IL6的过表达使凋亡受到抑制。用RTPCR法检测MCL1mRNA后发现，随着MCL1蛋白水平的增高，MCL1mRNA水平也逐渐增高，呈显著正相关，提示MCL1基因可能从mRNA水平就已经受到了IL6的调控。随着IL6的增加，细胞抗凋亡能力增强，抵抗免疫细胞攻击的能力增强，从而使肿瘤发生前的细胞或肿瘤细胞能够继续生长。因此，IL6介导的MCL1依赖的抗凋亡效应可能是人类宫颈致癌作用的一个重要机制。Wei等[2]的研究表明，在宫颈癌C33A细胞系中，IL6介导的MCL1上调所依赖的途径是PI3K/Akt，这与人类肝癌和前列腺癌中IL6介导的MCL1上调所依赖的途径是一致的。这一途径能够影响多重细胞的进程，包括增加细胞增殖、抑制凋亡，并且最终利于肿瘤发生。

综合研究结果可以得出：IL6在宫颈癌发生、发展过程中不仅可以促增殖和血管生成，还能调节细胞的凋亡。这一发现有助于对早期癌前病变的筛查，并为宫颈癌的治疗提供了新的思路。

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