TLRs与HBV宫内传播的研究进展

作者：张云

 作者单位：吉林医药学院

【摘要】  TLRs是一类模式识别受体，能够被病原体的特异性成分和某些宿主分子所激活，在先天免疫系统中起着决定性的作用。本文的目的是探讨TLRs在乙型肝炎病毒宫内传播中的作用，目前尚无相关报道。但越来越多的证据显示滋养层细胞通过表达TLRs能识别病原体并作出相应反应，而且有研究显示TLRs在病毒性肝炎的发生及发展机制中有相当作用，这对乙型病毒型肝炎宫内传播的发病和防治研究有所帮助，故本文从TLRs在妊娠中母体胎儿界面上的作用和在乙型病毒型肝炎中的作用两方面来进行综述。

【关键词】  TLRs HBV 宫内感染 先天免疫 妊娠 滋养层细胞

    先天免疫系统是机体防御病原体入侵的第一道防线，对于宿主而言最大的挑战就是通过有限的受体迅速识别大量不同的病原体并作出应答。1989年Janeway提出模式识别理论，将先天免疫针对的主要靶分子信号称作病原体相关的分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP）；相对应的识别受体称为模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR），这是先天免疫研究的里程碑。Toll样受体（TLRs）是一类主要的进化保守胚系编码的PRR，1997年Janeway和Medzhitov等在人类细胞表面发现，目前已发现11种人的TLRs家族成员［1］，分别命名为TLR1-11。由于TLRs通过识别不同病原体的PAMP，在先天免疫和宿主抵御反应中的重要性而倍受关注，本文从TLRs的结构、功能、信号转导途径方面就其与HBV宫内感染的研究现状进行综述。

    1  TLRs家族

    1.1  TLRs结构

    TLRs均属于I型跨膜受体蛋白质，可分为胞外区、胞浆区和跨膜区三部分。胞外区由18-31个富含亮氨酸的重复序列（Leucine rich repeats，LRR）和半胱氨酸结构组成，参与对病原体及其产物的特异性识别。胞质区由200个以上的氨基酸残基组成，与IL-lR家族成员胞浆区高度同源，因而被称为Toll/IL-1受体同源区（Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR），基本功能是通过同型蛋白-蛋白之间的相互作用进行细胞内信号转导，这是TLRs向下游传递信号的核心元件［2］。

    1.2  TLRs识别的配体

    机体大部分组织至少表达一种TLR，而有些则表达全部，在外周血白细胞中表达水平最高，单核/巨噬细胞、B细胞、T细胞及DC都表达TLR mRNA。近年来研究发现许多TLRs配体，TLR1（与TLR2形成异源二聚体）可识别脂蛋白或脂肽、可溶型脂蛋白；TLR2（与TLR1或TLR6形成异源二聚体［3］）主要识别细菌脂蛋白（BPLs）、肽聚糖（pGL）、脂磷壁酸（LTA）、脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）、可溶型结核因子（STF）、支原体巨噬细胞激活脂肽（MALP-2）、糖基磷脂、糖脂膜孔蛋白、酵母多糖、非典型LPS、热休克蛋白HSP70［4］；TLR3（胞内）可识别双链RNA（dsRNA）［5］、聚肌胞苷酸［poly（I∶C）］、mRNA；TLR4/CD14/MD-2复合物可识别LPS、紫杉酚（小鼠）、纤连蛋白III型重复外结构A、透明质酸寡糖、硫酸乙酰肝素多糖片段、血纤蛋白原、呼吸道合胞病毒融合蛋白、小鼠乳房肿瘤病毒衣壳蛋白、热休克蛋白60（HSP60）、热休克蛋白70（HSP70）、热休克蛋白Gp96（Gp96）；TLR5识别鞭毛蛋白［6］；TLR6（与TLR2结合形成异源二聚体）可识别酚可溶性调控蛋白（PSM ）、二酰基脂肽，余者识别的配体与TLR2相似。TLR7/TLR8（胞内）可识别咪唑喹啉/咪喹莫特［7］、咪唑醌醇/R-848、咪唑喹啉/S-27610、洛索立宾、Bropirimine、单链RNA（ssRNA）；TLR9（胞内）主要识别非甲基化CpG DNA［8］；TLR10尚无鉴定出的配体；TLR11可识别尿路致病性大肠杆菌（UPEC）。

    1.3  TLRs信号转导通路重要的接头分子

TLRs识别各自配体后，通过MyD88-IRAK-TRAF6激酶途径，IL-1/IL-1R模式中TIR区的信号转导模式主要为MyD88依赖性信号转导，活化下游MAPKs和NF-κB信号途径。但通过对MyD88基因缺陷小鼠来源细胞的分析研究显示，不同的TLRs能够诱导不同的基因表达，而且在TLRs家族不同成员的信号转导途径中，还存在着不依赖MyD88的方式。含TIR功能区的接头蛋白（TIR domain-containing adapter protein，TIRAP）又称Mal（MyD88-adapter-like），是MyD88激活下游分子的辅助蛋白，在TLR2和TLR4的信号转导过程中发挥着重要作用［9］。结构模式研究发现，TLR4可直接促使Mal发生寡聚化，而且TIRAP缺陷的巨噬细胞对TLR3、TLR7和TLR9与其配体的反应正常［10］。含Toll/IL-1受体功能区接头诱导的IFN-β（Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing interferon-beta，TRIF）又称含TIR的接头分子-1（TIR-containing adaptor molecule-1，TICAM-1），通过激活调节干扰基因转录的关键分子-干扰素调节因子（interferon regulating factor 3，IRF3）诱导IFNα/β基因的表达，仅作用于TLR3和TLR4的下游分子，这条途径也是MyD88非依赖型的。而TIR结构域的另一个配体分子一TRIF相关的接头分子（TRIF-related adaptor olecule，TRAM），它主要参与TLR4的信号转导［11］。

    2  TLRs与HBV宫内感染

    TLRs在机体内形成一个复杂的、联合性的、特异地识别大量病原体及组织代谢产物等的信号识别系统。研究显示TLRs在病毒性肝炎的发生及发展机制中通过影响IFN及调节Th1和Th2反应平衡等起重要作用，一些TLRs在抗病毒机制中显示出相当作用，这对病毒性肝炎宫内传播的发病和防治有所帮助。而人类胎盘是抵御病原体入侵的免疫屏障，并被认为是先天免疫系统的妊娠特异性组成部分，正常足月胎盘组织表达TLR1-10mRNA、表达TLR2和TLR4蛋白［12］。但是目前关于TLRs在HBV宫内感染中的作用尚无相关报道，只能从TLRs在妊娠中的作用及TLRs和乙型病毒型肝炎（HBV）的关系来探讨。

    2.1  TLRs在妊娠中的作用

    正常妊娠以先天免疫细胞在母体胎儿分界面出现为特征［13］，胎儿作为同种异体移植物种植在母体子宫，引起母体免疫变化从而对胎儿产生免疫耐受。一旦这种免疫耐受被细菌或其他的因素打破，像低效率清除病原体或过于活跃的免疫应答，将会导致母体胎儿分界面的炎症前期细胞因子水平增加，过早激活分娩机制，即免疫排斥导致早产。大量临床研究显示妊娠合并症和宫内感染有重要联系［14］，先天免疫反应可能影响妊娠结果。大肠杆菌作用于普通妊娠小鼠导致其早产，而C3H/HeJ小鼠由于缺乏有功能的TLR4，对大肠杆菌具有抵抗性而不发生早产，提示病原微生物通过TLRs刺激母体打破对胎儿的免疫耐受而导致早产。目前，早产和宫内感染的联系目前已经很好的建立。据报道高达40％的早产与感染有关［15］，发生在小于妊娠30周的早产80％有明显的感染，提示宫内感染可能发生在妊娠早期［16］。免疫细胞像巨噬细胞和NK细胞出现在母体胎儿分界面，但它们不是唯一能对致病病原体反应的细胞，除了经典的免疫细胞，胎盘细胞可能也有作为先天免疫系统的组成部分的潜在功能。

    目前，TLRs如何调节母体胎儿分界面的炎症反应尚处于研究的起步阶段，但越来越多的证据证明滋养层细胞可以通过TLRs受体的表达来识别病原体并做出应答。Ulrika Holmlund用免疫组化方法和反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）分析来自于正常足月妊娠的胎盘，虽然用TNF-α刺激人类胎盘TLR2和TLR4表达没有增加，但用酵母聚糖或LPS刺激胎盘导致IL-6、IL-8和TNF-α分泌增加，未刺激部位TLR2和TLR4蛋白和mRNA在相同高水平表达，证明足月绒毛膜滋养层细胞和中间滋养层细胞均表达TLR2和TLR4［17］。足月滋养层细胞用LPS处理后显示能诱导产生有抗菌效能的一氧化氮和MMP-2。Kirsi Harju等通过RT-PCR研究胎儿肺、肝、胎盘中TLr2和Tlr4 mRNA，证明TLRs的表达依赖于分化的不同阶段。但无论什么年龄，肝脏中都有TLR2和TLR4高水平表达，而在未成熟胎肺中几乎检测不到TLR2和TLR4表达。TLR2和TLR4在胚胎发育中成倍增加，出生后进一步增加。Kumazaki等［18］发现TLR4阳性胎盘细胞出现在足月绒毛膜外滋养层和中间滋养层上，提示滋养层细胞可能在病源微生物入侵部位与之相互作用，导致免疫反应。Guleria 和 Pollard提出滋养层细胞可能有作为先天免疫系统的活性成分的功能。Abrahams等在研究中评估了TLRs在妊娠早期滋养层细胞的表达，LPS激活TLR4引起妊娠早期细胞滋养层和绒毛膜滋养层细胞产生典型的TLR反应，以炎症反应和抗炎症反应细胞活素类分泌增多为特征，在妊娠早期胎盘组织中TLR2和TLR4均有高表达。有趣的是，妊娠早期滋养层细胞群表达这些受体是绒毛细胞滋养层和非绒毛滋养层。妊娠早期合胞体滋养层细胞不表达这些TLRs，这提示胎盘可作为高特异性屏障，保护胎儿发育防止感染［19］。因此，怀孕期间胎盘能够区分致病的还是共生的微生物，病原体类型和特异性受体可能对通过胎盘细胞产生反应类型有重要影响。他们还证明人类妊娠早期滋养层细胞构成隐匿化学增活素生长相关致癌基因、生长相关基因-α、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），而且能够补充单核细胞和NK细胞，补充中性粒细胞较少。其次通过病毒配体连接TLR3，或通过细菌LPS连接TLR4，滋养层化学活素类物质分泌明显增多，依次导致单核细胞和中性粒细胞趋化性提高。而且，TLR-3刺激也能诱导滋养层细胞分泌趋化因子。这些结果提示有特殊机制存在，在正常妊娠和宫内感染出现之间妊娠早期滋养层细胞可能差别调整母体免疫系统［20］。这些研究提示：对病原体的识别和反应，滋养层细胞功能和先天免疫系统功能确实相似。滋养层细胞不仅能识别病原微生物并启动免疫反应，它可能也产生抗生物肽，积极保护自己抵御病原体。研究证明滋养层细胞表达人类抗菌剂β防御素1和3。在滋养层细胞发现分泌白细胞蛋白酶抑制分子，是HIV感染有效的抑制剂，诱导细菌病势减退。TLR3通过滋养层细胞表达可能解释胎盘如何调整这些抗菌剂因子的表达。确实，妊娠早期滋养层细胞刺激，通过Poly（I：C）TLR3协同促进产生和分泌SLPI和IFN-β，两种重要的抗病毒因子［21］。这些因子是抵御病毒感染的第一道防线，而且有可能活化多种细胞内途径。因此，IFN-β和SLPI被滋养层细胞对病毒感染反应产生于母亲胎儿界面，可能表示潜在机制，在妊娠期通过这种机制胎盘防止HIV传递到胎儿。这些观察支持滋养层细胞能够保护自己和胎儿抵御感染性病原体。

2.2  TLRs与乙型病毒型肝炎

    在病毒性肝炎的发病机制中有免疫反应的参与，且免疫介导的肝损伤是乙型肝炎发病的主要机制，而TLRs在病毒感染中的作用越来越受到关注。Kurt-Jones等发现呼吸道合胞病毒（RSV）的一些融合蛋白能诱生促炎症细胞因子，TLR4能促进机体对病毒的清除，提示靶向TLR或CD14信号途径可能治疗病毒感染的新途径。研究发现物种通过TLR7和TLR8特异识别单链RNA（ssRNA），提示TLR7和TLR8参与宿主抗病毒反应。Lund等用敲基因技术研究发现TLR9介导HSV-2（herpes simplex virus-2）诱导IFN-α分泌，提示粘膜天然免疫的局部诱导可在粘膜表层为性传播疾病的感染如HSV-2或HIV提供保护［22］。

    从病毒感染到恢复的过程中细胞毒性T淋巴细胞起重要作用，已知病毒感染后I型IFN（IFNα/β）的产生是抗病毒作用的中心环节，而且也是目前病毒性肝炎抗病毒治疗的主要措施。已有研究证实一些TLR与I型IFN的产生有关。在哺乳动物细胞中，感染病毒或病毒复制中间体双链RNA通过特殊的信号途径诱导IFNα/β基因转录，从而产生抗病毒作用。Matsumoto M等研究表明，TLR3配体蛋白及其下游的信号分子均与IFNα/β的产生有关［23］。Hemmi等研究发现，在抗病毒反应中，MyD88缺陷小鼠的腹腔巨噬细胞不能合成TNF或IL-12等细胞因子，提示TLRs参与了反应。TLR7缺陷小鼠的巨噬细胞对Imidazoquinoline或R-848没有应答，而对其它TLRs激活剂有应答。此外，这些调节剂可诱导B细胞扩增及树突状细胞CD80和CD86的表达，而TLR7缺陷小鼠细胞的这两种作用都明显减弱。TLR7基因敲除小鼠的体外实验发现INF-α、TNF和IL-12的表达减弱。以上结果说明这些免疫反应调节剂是通过TLR7激活免疫细胞的，其靶细胞是淋巴样树突状细胞，它能够表达高水平的TLR-7，并且是INFs等抗病毒细胞因子的主要来源。Coccia等研究了病毒感染或TLR触发的单核细胞源性DC（MDDC）及浆细胞源性DC（pDC）I型IFN和IFNλ的表达，发现IFNλ和IFNβ协同表达在DC的成熟过程中至关重要。病毒性肝炎患者DC功能的下降可能与DC中TLR表达有很大相关性［24］。Masanori等为了检查不同TLRs对乙肝病毒复制的调整能力，对HBV转基因小鼠单独静脉注射对应TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9的特异性配体。所有的配体除了TLR2以外，均在24小时之内通过α/β干扰素依赖的方式抑制引起肝脏细胞病变的乙肝病毒复制。这些TLRs配体在HBV复制部位诱导抗病毒细胞活素类，提示TLR活化表示慢性乙肝病毒感染的一种新式强效的治疗策略。Schwarz等测试了TLR2、3、4、5、7、9信号传导能力，在带有病毒样颗粒的疫苗中增强细胞毒性T淋巴细胞反应，TLR2和TLR4兴奋未能增强CTL反应，而TLR3、TLR5和TLR7显示中等辅剂功能，而TLR9兴奋明显增强CTL反应，指示TLR9配体很可能是刺激CTL反应新的最有希望的辅剂成分［25］。Li等评价在小鼠模型中IMOs辅剂效能包括CpG、CpR、或R'pG基序和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）复合物。小鼠免疫脾细胞和HBsAg/IMO在离体抗原记忆试验中产生高水平IFN-γ，应用IMOs作为HBsAg佐剂在抗原剂量低至0.2微克时就能产生强抗-HBs。这些数据证明允许低剂量抗原接种，IMOs通过有效的Th1免疫应答增强HBsAg免疫原性［26］。

    3  小结与展望

    TLRs是一个生命体古老的防御机制，是迄今认识的第一个机体通过感知病原体直接作出防御反应的先天免疫受体。目前，我们对TLRs的结构、功能、信号转导途径方面已经有了初步研究。虽然尚无TLRs与HBV宫内感染关系的相关报道，但已有研究证明TLRs在妊娠期母体胎儿分界面的表达可以识别病原体并做出应答，而且TLRs在HBV的发生及发展机制中通过影响IFN及调节Th1和Th2反应等起重要作用。当然关于TLRs的功能及机制的研究尚处于起始阶段，仍有很多问题有待解决，TLRs在传导水平，活化过程如何受到体内外其它因素的调节；TLRs在机体组织细胞内分布广泛，相互之间是如何准确的协同作用； TLRs在乙型肝炎病毒宫内感染中究竟起到何种作用，如何用TLRs信号转导通路关键成分的基因多态性分析来揭示HBV宫内感染的基因基础；对TLRs导向的抗病毒新型药物的研究等。增强对TLRs及其整个系统的了解，将为感染性、炎症性、自身免疫性疾病的认识和研究开辟广阔前景，人类可能通过TLRs的功能找到新类型的免疫调节剂。

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