不同停搏液对体外循环后未成熟心脏内皮激活和炎性因子表达的影响

目前对婴幼儿心脏手术中最佳停搏液的理解仍是有限的,对阴.断时间较长的未成熟心脏采用何种停搏液能达到更好的保护效果也无定论.组氨酸一色氨酸-酮戊二酸(HTK)液有单次灌注、作用时间长等优点,但其主要成分组氨酸对冠状动脉内皮的保护尚有争议,含血停搏液的高钾和反复多次灌注也是对冠状动脉内皮保护不利的因素,内皮激活与炎性反应关系密切.本研究旨在观察体外循环(cpB)后冠状动脉血管内皮型一氧化氮合酶(egos)、血管内皮生长因子(VEGF)、心肌组织诱生型一氧化氮合酶(il\1o})及早期炎性细胞因子的表达,探讨两种停搏液对长时间停跳未成熟心脏保护作用的差异.　　材料与方法　　1.实验动物及实验设计:2周龄清洁级实验用乳猪14头(购自中国农业科学院),雌雄不限,体质量4.4一6.8kg,随机分为HTK液组(H组,n=?)和含血停搏液组(B组,n=7).两组均建立常规CPB,阻断主动脉后心肌保护方法:H组单次灌注40ml/kgHTK液(KoehlerChemi公司,德国),B组I}}I断灌注含血停搏液(fit.Thomas液和经氧合器抽出的血液按I:1混合).本实验方一案经阜外医院动物实验伦理委员会审查通过.　　2.实验方法:所有乳猪肌肉注射咪达U}仑(0.5mg/kg),氯胺酮(10mg/kg)、静脉注射芬太尼、咪达哩仑(0.2ml/kg),维库澳钱(0.4mg/kg)后气管插管,机械通气(Sal-inaHD'I02,德国),潮气量10ml/kg,It乎吸频率26一28次/111117,静吸复合维持全麻右颈动脉、颈内静脉分另!!置管,多功能监护仪(Philips公司,德国)监测心电图、动脉血压、中心静脉压、体温经正中开胸,全身肝素化后行升主动脉插管(8Fr导管)、下腔静脉插管(1乙18hr导管)体外循环采用人工心肺机和儿童膜肺(TerumobabyRX,日本)预充液含200nll新鲜猪全血和100ml6plc轻乙基淀粉,;ACT>480s,以100-150ml/(kg-min)流量开始转流,维持平均动脉压0-70rnmHg(]mmHg二0.133kPa),混合静I泳血氧饱和度65%以上鼻咽温降至300C,阻断主动脉,经主动脉根部灌注4℃停搏液,HTK液灌注压力起始为80100mmHg,维持为40一60mmHg,5一7min灌完;含血停搏液首量为20ml/kg,20一30min复灌,灌注压力为100一120nnnHg鼻咽温降至?5℃,低流量转流.主动脉阻断2h后开放,复温至360C停机.　　3.观察指标:CPB前、阻断前、开放后、停机、停机2h分别采动脉血作血气分析(I}OV;}(:CX,美国卜停机2h后,静注10%氯化钾5ml使心脏停跳,快速取左冠状动脉血管和左室心肌标本,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后放人液氮灌冻存血管和心肌标本在冰浴下加人细胞裂解液(每100mg组织加裂解液1ml)制备组织匀浆,在4℃下4000r/m离心15min,取上清液检测血管"EGLe10S的含量和心肌iNOS、肿瘤坏死因子一a(TNF-cx)、白细胞介素(IL)-1(3,IL-2的含量,采用试剂盒(R&D公司,美国)用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法测定,使用瑞士产GeniosPlus多功能荧光酶标仪测定吸光度(}1)值万、4.统计学方法:应用SPSS17.0统计软件分析计量资料以士’数土.午差表示,组间比较采用t检验或Mann-WhitneyU检验,计数资料的比较采用X检验,不同时点变量的比较采用重复测量分析.　　结果　　1.两组乳猪一般情况比较:乳猪体质量H组为(5.3士0.6)kg,B组为(5.6士0.9)kg,雌/雄比}I组为3/4,B组为4/3,两组乳猪体质量、性别比组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);两组CPB时间、降温时间、复温时间、最低鼻咽温、开放后室颤率、多巴胺和肾上腺素用量组间比较差异均无统计学意义(P>0.O5),但B组异体血用量明显大于H组(P<0.05)(表1).　　2.两组围术期心率、平均动脉压、中心静脉压、左房压等血流动力学参数和体温的变化:组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);在主动脉开放后即刻和开放后1h,H组血钠浓度分别为(130.411.7)和(134.1士2.4)mmol/L,B组血钠浓度分别为(139.4士1.3)和(140.7士0.9)mmol/L,H组血钠浓度较B组均明显降低(P<0.05);两组动脉血pH值、氧分压、二氧化碳分压、红细胞比容、乳酸、血糖、血氧饱和度(SvO,)的变化组间比较差异均无统计学意义(P>0.05).　　3.CPB后冠状动脉血管组织匀浆eNOS,Z'EGF'的含量:心肌组织匀浆iNOS,TNF-a,IL-1p和IL-2的含量,两组间比较差异均无统计学意义(P>0.05,表2).　　4冠状动脉血管eNOS,VEGF和心肌组织iNOS,TNF-cx,IL-1},IL-2含量的相关分析:心肌组织中iNOS与TNF-},IL-1日、IL-2含量呈正相关,Pearson相关系数分别为r=0.55(P<0.05),r=0.59(P<0.05)和r=0.60(P<0.05),TNF-a和IL-1}含量也显著相关(r=o.85,p<0.O1).　　讨论　　CPB手术中心肌的缺血再灌注损伤是炎性因子产生的主要来源之一,良好的冠状动脉内皮和心肌保护可以降低心肌内炎性反应程度.缺血损伤会引起eNOS下调,再灌注期冠状动脉血流减少,eNOS上调是保护冠状动脉内皮功能的重要调节因素「z-,,可以改善低氧导致的小动脉收缩、抑制中性粒细胞的粘附和渗出;VEGF在促进缺血心肌血管新生和侧枝循环形成、调节血管张力和通透性、改善冠状动脉血流方面起重要作用·a-s},因此,在CPB术后保持冠状动脉内皮eNOS和VEGF的正常表达,对改善微血管舒缩状态、降低血流阻力、减轻心肌缺血再灌注损伤具有重要意义.在CPB后肺损伤中,eNOS对肺脏有保护作用,而iNOS过度表达具有肺损伤作用.本实验结果表明,与含血停搏液比较,HTK液能保持eNOS,VEGF在冠状动脉血管内皮的表达,不增加心肌组织i10S的表达,这可能与未成熟心肌的代谢特点和HTK液的优良特性有关.与成熟心肌比较,未成熟心肌在缺血期间能产生更多的丙氨酸、唬拍酸和苹果酸根,无氧代谢能力更强,并含有更多的自由氨基酸可供急性低氧时消耗,因而对缺血有更好的耐受Hiramatsu等fi的研究证实未成熟心脏在低温缺血再灌注后有更好的内皮功能和冠状动脉血流的恢复.同时,HTK液有强大的酸缓冲能力,其含有的酮戊二酸可以补充能量代谢底物,色氨酸可以稳定细胞膜,低钾含量可减轻对内皮的损害,从而对心脏提供长时间的良好保护本研究结果显示,心肌组织中iNOS与TNF-a,IL-1日,IL-2含量均呈显著正相关,提示iNOS与心肌内早期炎性反应密切相关.TNF-.和IL-I(3是早期升高的促炎因子,可通过激活中性粒细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞等促进氧自由基和其他炎性介质的释放;IL-2是早期升高的抗炎因子.iNOS参与心肌损伤的机制尚不清楚,可能通过产生NO及其他含氮自由基发挥细胞毒作用和干扰酶的代谢,并可与巨噬细胞分泌的炎性因子相互作用而加重炎性反应二本研究结果显示,冠状动脉eNOS和VEGF含量与心肌组织iNOS含量并无明显相关性,可能与iNOS的表达受多种刺激因素调控有关,如TNF,IL及其他致炎因子均可刺激iNOS在多种细胞中表达is},使其在缺血再灌注损伤和炎性反应的病理过程中都起了重要作用HTI液和含血停搏液对CPB后心肌组织中iNOS和早期炎性因子表达的影响差异无统计学意义,说明两者在防止未成熟心肌发生过度的炎性反应卜有相似的作用.　　目前国内外不同的七科中心对停搏液的选择有所不同,HTK液是否适合用于对长时间缺血的未成熟心肌的保护尚存争议,按照钱有辉等[y的研究结果,HTK液的钾、钙等成分一也不符合对未成熟心肌保护最适宜的浓度,因而其心肌保护效果有待评价.含血停搏液的配方可有多种不同的成分和比例,由于1:1含血停搏液是发达国家采用的主流配方,我们将HTK液和1:1含血停搏液进行比较,研究结果发现,无论在内皮激活还是在心肌早期炎性细胞因子的释放上,HTK液和l:1含血停搏液差异无统计学意义,两者在防止心肌内炎性损伤上有相似的作用.因此,对阻断时间在2h以内的未成熟心脏,HTK液有与含血停搏液相似的保护作用,可以在婴幼儿中安全应用.HTK液有单次剂量灌注、避免反复灌注造成未成熟心肌水肿、保持无血的术野、不干扰复杂手术的操作、减少预充用血量等优点,其中减少异体血的输人对缩短婴幼儿心脏手术后机械通气时间、促进患儿康复有积极的作用.　　它注意的是,HTK液会引起不同程度的血钠下降,应积极预防,避免发生严重的低钠血症.　　参考文献　　Koch A,Radovits T,Loganathan S. 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