谷胱苷肽-S-转移酶P1基因在人结肠癌细胞株中的表达及启动子区甲基化的研究

人LIGHT是1998年发现的新的肿瘤坏死因子超家族成员，是家族的第14个成员(TNFSFI4),LIGHT蛋白为11型跨膜蛋白，因能与疤疹病毒侵人介体(HVEM)和淋巴毒素日受体(LT(3R)两个独特的功能受体结合，又称为HVEM-L。研究结果显示LIGHT可通过分泌性及可溶性的形式抑制肿瘤细胞的生长及发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用，同时，LIGHT在发挥抗肿瘤作用时还可能刺激T细胞的活化，因此具有潜在的肿瘤治疗价值i}}。但口前对一LIGHT的抗肿瘤机制研究报道尚少。我们通过构建LIGHT慢病毒表达载体，观察慢病毒介导的LIGHT在结直肠癌细胞HCTl16中的表达及对HCT116细胞的作用.　　材料与方法　　1.材料:结直肠癌细胞株HCT116购自中国科学院上海细胞库;质粒pLenti购自本元正阳公司;HotStarTadDNAPolymerase购自Qiagen公司，?DNA/HindIII+EcoRIMarker,RNAisoPlusReagent和SYBRPremixExTad及内切酶BamHl,Sal1购自TaKaRa公司;人LIGHT/TNFSPI4酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自R&D公司;质粒提取试剂盒购白Omega公司;Polybrene购自Sigma公司;pAAV-LIGHT质粒由本实验室构建，引物合成及DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。　　2.寡核昔酸链的设计:人LIGHT全长〔:DNA扩一增引物为5'-CGCGGATCCATCG.AGGAG.-1GTGTCG-3和5-CTCGTCGACTCACACCATGAAAGCCCC-3’，检测引物为5’-GTACGGCCCTCAGTGTTTGTG-3’和5’-CCCA-TCAGCAACAGCAAG_AGA-3’，一甘油醛_3一磷酸脱氢酶(GAPDH)检测引物为5'-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3’和5’一GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3’。　　3重组载体的构建:以pAAV-LIGHT质粒为模版扩增LIGHT片段，聚合酶链反应(PCR)产物经Sal1+BamHI双酶切后电泳切胶回收，亚克隆人pLenti质粒中。重组质粒pLenti-LIGHT经SalI+BamHI双酶切和测序鉴定。　　4.慢病毒的包装及纯化:重组慢病毒Lenti-LIGHT由北京本元正阳公司负责完成。　　5.慢病毒介导的LIGHT在HCT116细胞中的表达:(1)慢病毒对HCT116的感染效率:HCTl16细胞生长至对数生长期，以2.0x1了个细胞接种于96孔板，以第2天s0%融合为宜，慢病毒以不同感染复数(MOI为0,1,2,s,10)感染细胞(加人Polybrene，终质量浓度6m扩I),6h后换新鲜培养液(无Polpbrene)，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。(2)重组慢病毒Lenti-LIGHT对HCT116细胞LIGHT表达的影响:将HCTl16以8.0x104个/孔接种于24孔板，Lenti-LIGHT以最适的MOI感染细胞。实验分为3组:空白对照组、阴性对照组(Lenti、实验组(Lenti-LIGHT组)，分别于感染后12,24,48,72h和sa}因细胞长满，培养液变黄，72h后各细胞孔换新鲜培养液)收集细胞和细胞培养上清。细胞离心后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，参照文献[4」提取细胞的总RNA,逆转录成cDNA，实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)检测各组HCT116细胞中LIGHTmRNA的表达。　　ELISA法检测各组细胞培养上清中LIGHT蛋白表达(按照试剂盒操作说明书进行)。实验设3个复孔，重复3次6.嚷哩蓝(M'1'T)实验:慢病毒感染后48h的上述3组细胞分别以每孔1x10'个细胞接种到%孔板，每孔体积100闪,6个复孔。370C,5%COz的条件下培养48h后，每孔加MTT溶液(5群L)10}1。继续孵育4h,终止培养，小.I吸弃孔内培养上清液。每孔加150闪二甲基亚飒(DMSO)，在震荡器上振荡10min，使结晶物充分融解。在酶联免疫检测仪上测定490nm波长吸光度(A夕值，取平均值，计算细胞相对生长增殖率。相对生长增殖率(%)=几实g/A}。组x100%。　　7.统计学方法:数据以均数士标准差表示。应用SPSS11.5统计软件分析，组间比较采用t检验。　　结果　　1.重组质粒的鉴定:LIGHT基因PCR、重组质粒pLenti-LIGHT经SalI+BamHI双酶切1.5%琼脂糖凝胶电泳验证见图10PCR产物大小约750by，重组质粒酶切后出现6.6kb和750by两条带，与预期相符。　　送重组质粒测序，经序列比对与Genebank中序列完全一致，证明重组质粒pLenti-LIGHT克隆成功。　　2.慢病毒的包装及纯化:本元正阳公司提供的慢病毒的病毒滴度达1.96x10}TU/mlo3.慢病毒对HCT116的感染效率:随着病毒的MOI增加，细胞中绿色荧光蛋白的表达强度逐渐增强，感染效率也逐渐增高。24h后高MOI组可见部分细胞有绿色荧光表达，48h后绿色荧光明显增加，72h后绿色荧光增加更明显(MOI为。,1,2,5,10时72h感染效率分别为。%,}0%,92%、>95%、>95%)，说明慢病毒对HCT116感染效率高。但MOI值越大，细胞形态变化越大、收缩越严重，MOI超过5后，细胞出现明显的细胞病变效应，细胞会漂浮，活性严重受损。所以本研究选择IVIOI为2进行实验观察。　　4.慢病毒对HCTl16细胞LIGHT表达的影响:3组细胞的Real-timePCR扩增曲线呈典型S型，融解曲线为单峰。各组细胞的内参照基因GAPDH的Ct值变化很小，表明各组细胞的起始模板量基本恒定。Real-limePCR检测显示Lenti-LIGHT组细胞中LIGHTmRNA的表达水平逐渐增高，慢病毒感染24,48,72,120h后，细胞中LIGHTmRNA的表达量分别是空白对照组的19.03,68.59,94.35和11.71倍，明显高于空白对照组和慢病毒对照组(P<0.05,图2),Lenti对照组与空自对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)}ELISA结果显示Lenti-LIGHT组细胞中[i.IGHT蛋白表达也相应增加，重组慢病毒组细胞中LIGHT蛋白含量从12h的0增加到72h的11.36},郭L(P<0.05，图3)。空It1对照组和Lenti对照组各时间点、Lenti-LIGHT组细胞的12h组与空白细胞培养液的.9值相近，差异无统计学意义(P>0.05)，说明HCT116细胞本身不表达或低表达LIGHT蛋白。　　5.LIGHT}寸HCTI16细胞增殖活性的影响:与空白对照组比较，Lenti-LIGHT组的细胞明显较少，Lenti对照组的细胞差异无统计学意义(P>0.OS);Lenti对照组和Lenti-LIGHT组的相对生长增殖率分别为(0.94t0.I4)%和(0.72士0.1O)%，说明LIGHT蛋白的表达对细胞的生长有一定抑制作用.　　讨论　　肿瘤的的发生和发展是由于肿瘤细胞逃避了免疫系统的攻击，提示免疫系统无法察觉和清除肿瘤细胞，肿瘤抗原不能刺激机体产生有效的免疫应答,5]。如果肿瘤细胞转染了免疫调节因子基因则能诱导特异性的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤生长受到抑制或坏死。基因治疗已成为肿瘤的治疗手段，而有效的基因转导载体系统是基因治疗的关键。我们所用的慢病毒载体属于“第3代”慢病毒载体，其基因组的3'LTR的增强子功能发生了缺失，该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，具有较好的安全性。慢病毒载体的感染效率高，自身抗原性弱，可操控性强，能够提供高效的基因转移和长期稳定的蛋自表达m并且该慢病毒载体带有绿色荧光蛋白表达，可以判断病毒颗粒对细胞的转染效率。　　我们以LIGHT为目的基因，成功构建了LIGHT慢病毒表达载体并包装了重组慢病毒。该病毒感染HCT116细胞后，Real-timePCR和ELISA结果显示LIGHT基因和蛋白在HCT116细胞中获得高效表达，慢病毒感染72h后，细胞中LIGHTmRNA的表达量是空白对照组的94.35倍，LIGHT蛋白含量为11.36},剔L;空白对照组和I,enti对照组各时间点的LIGHT蛋白无法检测到，说明HCT116细胞本身不表达或低水平表达LIGHT蛋自MTT结果显示Lenti-LIGHT组的细胞相对生长增殖率为(0.72士0.10)%，说明LIGHT蛋白的表达对细胞的生长有一定抑制作用。　　参考文献　　Sobti RC,Kaur S,Kaur P. Interaction of passive smoking with GST (GSTM1,GSTT1,and GSTP1) genotypes in the risk of cervical cancer in India[J].Cancer Genetics and Cytogenetics,2000.117-123.　　Li Z,Zhang H,Yang J. Promoter hypermethyhtion of DNA damage response genes in hepatocellular carcinoma[J].Cell Biology International,2012.427-432.　　Jentzmik F,Krause H,Reichelt U. GSTP1 CpG island hypennethylation for DNA-based detection of occult tumor cells in surgical margins after radical prostatectomy[J].World Journal of Urology,2012.541-546.　　朱宝益,李小娟,蔡松旺. miR-96调控生育酚结合蛋白的表达及前列腺癌细胞生长[J].中华实验外科杂志,2012,(6):1059-1061.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.06.022.　　Chuang CK,Chu DC,Tzou RD. Hypermethylation of the CpG islands in the promoter region flanking GSTP1 gene is a potential plasma DNA biomarker for detecting prostate carcinoma[J].Cancer Detection and Prevention,2007.59-63.