脐带血血浆在人巨细胞病毒垂直传播中的作用
发表时间:2014-05-16 浏览次数:757次
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)属疱疹病毒亚科,在人群中感染普遍,受HCMV感染的个体可终身携带病毒,并在唾液、尿液、精液、宫颈分泌物和(或)乳汁中间断地排除病毒[1]。HCMV可通过胎盘、产道及泌乳方式由母体传染给子代,目前HCMV发生垂直传播的方式和途径尚不清楚[2]。本文通过对新生儿脐带血白细胞和血浆中的HCMV基因检测研究,初步探讨脐带血血浆在HCMV垂直传播中的意义,为新生儿HCMV先天性感染的早期诊断和防治提供依据,现将结果报告如下。1 对象与方法1.1 研究对象随机抽取合肥市妇幼保健院2010年11月~2011年3月的健康顺产妇女所产新生儿的脐带血为研究对象,共51份。脐带血采集方法:当胎儿娩出后立即断脐,消毒,封闭式采集脐血,至胎盘剥离停止采血,脐血收集至无菌、加有抗凝剂的三角瓶中,4 ℃保存备用。本研究中51例新生儿均为足月产儿,体重均大于2.5 kg,新生儿的神经反射及听力测试均正常。有6例新生儿出生时羊水异常,其中4例羊水污染,2例羊水过少。1.2 细胞株及病毒株阳性对照的HCMV AD169株由复旦大学医学院微生物教研室提供。接种AD169株的6~8代人成纤维细胞株是按本实验室常规方法制备。1.3 试剂来源HCMV巢式PCR引物参照Lukacsi等[3]研究,由上海英骏生物技术有限公司合成。DNA提取试剂盒购自Solarbio公司。DNA IQ? system-small sample casework protocol试剂盒购自Promega公司。异硫氰基荧光素(FITC)标记的HCMV pp65单克隆抗体购自美国Millipore公司,HCMV IgG检测试剂盒购自意大利DIESSE公司。1.4 方法1.4.1 标本处理脐带血(抗凝):2500 r/min离心5 min,吸取血浆。剩余血细胞中加入5倍体积的红细胞裂解液,10 min后离心,弃上清,重复裂解1次,收集白细胞于200 μl生理盐水中成白细胞悬液,血浆及白细胞悬液-20 ℃保存备用。利用Solarbio公司的DNA提取试剂盒提取白细胞DNA,-20 ℃保存备用。利用Promega公司的微量DNA提取试剂盒提取血浆DNA,-20 ℃保存备用。1.4.2 HCMV UL55基因巢式PCRHCMV UL55基因巢式PCR外侧上游引物序列为5'-GGAAACGTGTCCGTCTTTGA-3',其下游引物序列5'-GAGTAGCAGCGTCCTGGCGA-3';内侧上游引物序列为5'-GGAACTGGAACGTTTGGC-3',其下游引物序列5'-GAAACGCGCGGCAATCGG-3',最终PCR产物为285 bp。首轮PCR反应体系25 μl:外侧引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、MgCl2 0.75 μl、10×Buffer 2.5 μl、无菌水18 μl以及DNA模板2 μl。循环参数设置:95 ℃ 3 min,然后95 ℃变性30 s,54 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min, 35个循环后,72 ℃延伸10 min。第二轮PCR反应容积为25 μl:内侧引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、MgCl2 0.75 μl、10×Buffer 2.5 μl、无菌水18 μl以及首轮反应产物2 μl。循环参数设置:95 ℃ 3 min,然后95 ℃变性30 s,60 ℃ 40 s,72 ℃1 min, 35个循环后,72 ℃延伸10 min。取扩增产物6 μl进行1%琼脂糖凝胶电泳。阴性对照应无条带,阳性对照、检测标本出现符合扩增片段大小的条带可判为阳性,否则应判为阴性。1.4.3 测序巢式PCR扩增的产物,用PCR内侧引物作为测序引物,由上海Invitrogen贸易有限公司进行测序,并采用NCBI在线工具BLAST进行序列比对。1.4.4 HCMV pp65抗原检测PBS冲洗涂片2次;1%Triton100,37 ℃,10 min破膜;PBS洗涤后37 ℃避光封闭1 h;FITC标记的pp65(1∶150稀释)单克隆抗体免疫荧光染色,37 ℃孵育2 h;PBS洗涤后,DAPI 37 ℃避光染色10 min;0.1%伊文思蓝37 ℃避光复染10 min;80%甘油封片;使用荧光显微镜观察结果,蓝色为DAPI染色的胞核,红色为伊文思蓝着色的包膜结构,绿色或黄绿色荧光为FITC标记的pp65蛋白阳性信号,HCMV pp65抗原阳性细胞数≥5个/2×105单个核细胞为抗原阳性。1.4.5 HCMV IgG 抗体检测脐血血清HCMV IgG抗体检测,按意大利DIESSE试剂盒说明书操作。结果判定用吸光度法,以酶标光度仪检测各孔吸光度值(optical density,OD),检测波长450nm,样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1判定为阳性。1.5 统计分析使用Excel 2003录入数据,采用SPSS 16.0软件进行统计分析,定性资料两组间比较采用配对2检验,检验水准α=0.05。2 结果2.1 新生儿脐带血白细胞及血浆HCMV UL55基因巢式PCR51份新生儿脐带血白细胞HCMV UL55基因巢式PCR检测发现,阳性数为16份,阴性数为35份,阳性率为31.4%,见图1。 51份新生儿脐带血血浆HCMV UL55基因巢式PCR检测,阳性数为17份,阴性数为34份,阳性率为33.3%,见图2。HCMV UL55基因巢式PCR阳性标本的测序结果与巢式PCR引物设计的序列相一致。测序结果利用NCBI在线工具BLAST进行序列比对,证明为HCMV UL55基因。2.2 51份新生儿脐带血白细胞及血浆DNA、HCMV巢式PCR结果比较51份新生儿脐带血白细胞与血浆利用HCMV UL55基因巢式PCR检测后,注:1为DNA marker;2~10、12、16为阴性标本;11、13~15为阳性标本;17为阳性对照;18为阴性对照。 图1 新生儿脐带血白细胞DNA HCMV巢式PCR结果 注:1为DNA marker;5、6、14、15为阳性标本;2~4、7~13、16为阴性标本;17为阳性对照;18为阴性对照。图2 新生儿脐带血血浆DNA HCMV巢式PCR结果两者的阳性标本一致数为12份,阴性标本一致数为30份,一致数共为42份,一致率为82.4%,两者差异无统计学意义(2=0.00,P=1.000),见表1。表1 51份新生儿脐带血白细胞及血浆HCMV巢式PCR结果比较2.3 18份新生儿脐带血pp65抗原血症检测结果pp65抗原血症检测病毒蛋白表达,是检测HCMV活动性感染的一个重要指标。随机选取18份新生儿脐带血白细胞利用pp65抗原血症检测,阳性标本数为6份,阳性率为33.3%。2.4 18份新生儿脐带血白细胞pp65抗原血症检测与血浆DNA巢式PCR结果比较上述随机选取的18份脐带血其血浆DNA巢式PCR阳性为5例,阳性率为27.8%,与pp65抗原血症结果相比较,阳性一致数为2份,阴性一致数为9份,一致数共为11份,一致率为61.1%,两种方法的检测结果间差异无统计学意义(2=0.00,P=1.000),见表2。表2 脐带血白细胞pp65抗原血症检测与血浆DNA巢式PCR结果比较2.5 HCMV IgG检测结果51份新生儿脐带血血清利用意大利DIESSE的ELISA试剂盒检测HCMV IgG,得出HCMV IgG阳性标本数为48份,阳性率为94.1%。其中脐带血白细胞、血浆HCMV DNA阳性的标本及HCMV pp65抗原血症结果阳性的标本,其HCMV IgG均为阳性。3 讨论脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液,是母亲和胎儿进行物质交换的枢纽,张睿等[4]、付锦华等[5]研究认为从脐血或产后早期新生儿器官、绒毛及胚胎中检出HCMV DNA即可诊断为先天性HCMV感染。本研究中,笔者通过利用HCMV UL55基因的巢式PCR检测新生儿脐带血DNA,初步了解合肥地区新生儿HCMV先天性感染率约为31.4%。目前HCMV发生垂直传播的方式和途径尚不清楚。动物实验显示,首先胎盘感染,大量的白细胞积聚在绒毛间腔,HCMV感染的细胞内显示特征性的包涵体,紧接着病毒通过胎盘屏障到胎儿体内。另一种途径是感染的白细胞通过脐血管进入胎儿循环——血源性病毒传播。这表明在HCMV垂直传播中,白细胞在携带、传播病毒中起重要作用。Spector等[6]将HCMV DNA 阳性血浆通过0.2 μm孔径滤膜后, 取滤液接种到包皮成纤维细胞上培养,出现特征性细胞病变,证明HCMV DNA阳性血浆中存在游离的(无细胞的Cell-free) HCMV,可导致HCMV传播,这提示血浆在HCMV垂直传播中可能起携带与传播病毒的作用。本研究结果表明,脐带血白细胞和血浆中HCMV DNA的阳性率基本相似,且一致率较高(82.4%),两者差异无统计学意义,且灵敏度及特异性都较高,这进一步证实了HCMV垂直传播中血浆可能起携带与传播病毒的作用。血管内皮细胞也是HCMV复制和增殖的场所[7],本研究的血浆中HCMV UL55基因阳性率略高于白细胞,这可能是由于HCMV在血管内皮细胞中复制及增殖,释放入血,存在于血浆中。今后笔者将通过扩大标本量,定量检测新生儿脐带血血浆中HCMV DNA的拷贝数及蛋白表达情况来进一步研究和探讨血浆在HCMV的垂直传播中所起的携带与传播病毒的作用。目前多形核白细胞中的HCMV-pp65抗原血症已被公认为HCMV活动性感染的重要标志。闻良珍[8]认为血浆中HCMV DNA阳性代表活动性感染,但目前尚存在争议。本研究中随机抽取其中18份新生儿脐带血白细胞利用pp65抗原血症进行检测,阳性标本数6份,阳性率为33.3%,与此18份血浆DNA巢式PCR结果相比较,阳性一致数为2份,阴性一致数为9份,一致率为61.1%,一致率较高,经检验两者差异无统计学意义。这表明,血浆中HCMV DNA的检出与HCMV活动性感染具有一定的相关性,这也进一步提示血浆在HCMV垂直传播中可能起携带病毒导致病毒传播的作用。另外,本研究还对51份新生儿脐带血血浆进行了HCMV IgG的检测,结果表明HCMV IgG阳性标本数为48份,阳性率为94.1%。其中脐带血白细胞、血浆HCMV DNA阳性的标本及HCMV pp65抗原血症结果阳性的标本,其HCMV IgG均为阳性。但由于HCMV IgG能够穿过胎盘,由母体传播至胎儿,所以脐血中HCMV IgG检测出阳性,并不能代表新生儿先天性HCMV感染,所以在此HCMV IgG阳性的结果仅作为参考。【参考文献】[1] Paixao P, Almeida S, Gouveia P, et al. 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