血管紧张素－（１-７）对野百合碱所致肺动脉高压的影响

　　作者：陈丽星,廖新学,孙金华　　作者单位：1. 中山大学附属第一医院心内科//心血管研究所， 广东 广州 510080; 2. 云南省妇幼保健院， 云南 昆明

　　【摘要】【目的】　探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对野百合碱 (MCT)诱导的肺动脉高压的作用及相关机制。【方法】　雄性Sprague-Dawley大鼠80只随机分为： 正常对照组(control)、MCT组、MCT + Ang-(1-7)组、control + Ang-(1-7)组。MCT组和MCT + Ang-(1-7)组颈静脉注射MCT 60 mg/kg，24 h后经微泵持续泵入生理盐水或Ang-(1-7) (24 μg•kg-1•h-1)。control和control + Ang-(1-7)组颈部注射生理盐水，24 h后经微泵泵入生理盐水或Ang-(1-7) (24 μg•kg-1•h-1)。治疗4周后测定大鼠的右室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI)，测定肺小动脉管壁厚度(WT)占动脉外径(ED)的百分比(WT%)及管壁面积(WA)占血管总面积的百分比(WA%)。通过放射免疫方法检测血浆及肺组织中血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)浓度。Western blot分析肺组织中细胞外调节蛋白激酶1/2 ( ERK1/2)磷酸化水平。 【结果】　与control组相比，MCT组RVSP、RVHI、WT%、WA%、肺组织AngⅡ浓度、ERK1/2磷酸化水平显著升高(P < 0.01); MCT + Ang-(1-7)组与MCT组相比， RVSP、RVHI、WT%、WA%、ERK1/2磷酸化水平均明显降低(P < 0.01);control组、control + Ang-(1-7)组、MCT + Ang-(1-7)组三组间RVSP、RVHI、WT%、WA%、ERK1/2磷酸化水平差异无显著性意义(P > 0.05)。 【结论】　在MCT诱导的肺动脉高压模型中，Ang-(1-7)可能通过降低 ERK1/2磷酸化水平，抑制肺血管的重构，预防肺动脉高压的发生。

　　【关键词】 血管紧张素-(1-7),野百合碱,肺动脉高压; 重构

　　Abstract：　【Objective】 To investigate the effect and mechanism of Ang-(1-7) on pulmonary arterial hypertension induced by MCT. 【Methods】 Eighty Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups： control group， MCT group， MCT + Ang-(1-7) group， and control + Ang-(1-7) group. Twenty-four hours after injection of MCT， the rats in MCT + Ang-(1-7) group and MCT group were allocated to intravenous infusion of either Ang-(1-7) (24 μg•kg-1•h-1) or saline by osmotic minipumps. Twenty-four hours after injection of saline， rats in control + Ang-(1-7) group and control group were allocated to intravenous infusion of either Ang-(1-7) (24 μg•kg-1•h-1) or saline by osmotic minipumps. After 4 weeks of treatment， right ventricular systolic pressure (RVSP) and right ventricular hypertrophy index (RVHI) were measured. Percentage of wall thickness (WT%) and percentage of wall area (WA%) of pulmonary arterioles were evaluated. AngiotensinⅡ(AngⅡ) concentration in plasma and lung were measured by radioimmunoassay. ERK1/2 activation was analyzed by Western blotting. 【Results】 After four weeks， these parameters of RVSP， RVHI， WT%， WA%， pulmonary AngⅡconcentration and the level of phosphorylation of ERK1/2 in MCT group were significantly increased compared with control group (P < 0.01). The parameters of RVSP， RVHI， WT%， WA%， and the level of phosphorylation of ERK1/2 in MCT + Ang-(1-7) group were significantly decreased compared with MCT group (P < 0.01). There were no significant difference concerned RVSP， RVHI， WT%， WA%， and the level of phosphorylation of ERK1/2 among control group， MCT + Ang-(1-7) group， and control + Ang-(1-7) group (P > 0.05). 【Conclusion】 Down-regulation of the level of phosphorylation of ERK1/2， Ang-(1-7) can inhibit pulmonary vascular remodeling and prevent the development of pulmonary arterial hypertension.

　　Key words： angiotensin-(1-7); monocrotaline; pulmonary arterial hypertension; remodeling

　　野百合碱(Monocrotaline，MCT)是从植物中提取的生物碱，它本身无活性，经代谢生成有活性的吡咯野百合碱后攻击肺的血管床，使血管内皮细胞受损、血管平滑肌细胞迁移、增殖，肺血管重构，导致肺动脉压升高和右心衰竭[1]。颈部注射野百合碱诱导的肺动脉高压模型由于较好的模拟了肺动脉高压形成的病理过程，因而被广泛用于肺动脉高压有关机制的研究[2]。目前研究发现，血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)可降低肺动脉压，抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖[2-3]。ACEI和ARB可明显增加血浆中Ang-(1-7)水平[4]，提示Ang-(1-7)在ACEI和ARB的生物学作用中有重要地位。本课题组研究发现，Ang-(1-7)可抑制体外培养的血管平滑肌细胞增生，可减轻压力负荷增高所致的心肌肥厚程度，可减轻心肌梗死后心室重塑[5-6]。但直接给予外源性的Ang-(1-7)是否可降低肺动脉压，抑制肺血管平滑肌细胞的增殖，目前国内外尚未见相关报道。我们通过建立野百合碱诱导的肺动脉高压模型，外源性给予Ang-(1-7)，研究Ang-(1-7)对肺动脉压力及肺血管重构有何影响，并探讨其可能的机制，为肺动脉高压的治疗提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1　材 料

　　1.1.1 动 物 本实验室所用Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF级)由中山大学实验动物中心提供，在该中心饲养(SPF级)，恒温(22 ± 2) ℃、恒湿(55 ± 5) %，人工光照明暗各12 h。

　　1.1.2 试剂和仪器 Ang-(1-7)购于美国Bachem公司;2ML4型微泵购于美国Alzet公司;MCT购于美国Sigma公司;兔源性抗p-ERK1/2多克隆抗体及抗t-ERK1/2多克隆抗体购于美国Cell Signaling公司;AngⅡ放射免疫试剂盒购于北方免疫试剂研究所;Western blot检测试剂盒购于中国武汉博士德生物工程有限公司;PE-50聚氯乙烯导管来自中山大学辅助循环实验室。

　　1.2　方 法

　　1.2.1 实验动物分组设计及肺动脉高压模型的建立 雄性SD大鼠80只，质量280 ～ 320 g，随机均分为4组： control、MCT组、MCT + Ang-(1-7)组和control + Ang-(1-7)组。先把MCT溶于适量1 mol/L盐酸中，然后以0.1 mol/L氢氧化钠调节pH至7.3，最后用生理盐水配置成终浓度为20 mg/mL的溶液。MCT组和MCT + Ang-(1-7)组：一次性颈部皮下注射MCT 60 mg/kg，在MCT注射后第2天，MCT + Ang-(1-7)组将Ang-(1-7)溶于2 mL生理盐水后放入2ML4型渗透性微泵内，埋置颈部皮下，经左侧颈静脉插管持续给药，剂量为24 μg•kg-1•h-1 [7]共4周;MCT组经微泵给予2 mL生理盐水共4周。control和control + Ang-(1-7)组给予1 mL生理盐水颈部皮下注射，第2天经微泵分别给予2 mL的生理盐水和剂量为24 μg•kg-1•h-1 [7] 的Ang-(1-7) 共4周。

　　1.2.2 右心室收缩压的测定 4周后，用10%的水合氯醛按3 mL/kg浓度腹腔内注射将动物麻醉，暴露并游离右颈外静脉，将PE-50聚氯乙烯导管从右颈外静脉插入。插入1 ～ 2 cm可到达上腔静脉，2 ～ 3 cm可到达右心房，4 cm左右可到达右心室，导管连接生物信号采集系统，根据压力曲线波形变化判断导管位置。记录右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)，以此来反映肺动脉收缩压。

　　1.2.3 右心室肥厚指数的测定 取出心脏，沿房室沟剪去左、右心房及大血管根部，沿室间隔将心室剪为右心室游离壁和左心室加室间隔两部分并称重，计算两者质量的比值，右心室肥厚指数(right ventricle hypertrophy index，RVHI)=右心室游离壁(RV)/左心室 + 室间隔(LV + S) [8]。

　　1.2.4 组织标本的制备及指标的观察 测定右室压后，处死动物，将右下肺浸入40 g/L多聚甲醛溶液固定，常规石蜡切片，HE染色，随机选管径在50 ～ 100 ?滋m肺小动脉各10根，运用Imagepro Plus图像分析软件测定管壁厚度(wall thickness， WT)、管径(external diameter， ED)、管腔面积(luminal area， LA)，管总面积(Total area， TA)。计算肺小动脉管壁厚度占管径的百分比WT%(WT% = 2•WT/ED•100)及管壁面积(wall area， WA)占血管总面积的百分比WA%[WA % = ( TA-LA)/TA•100 ] [8]。将WT%和WA%作为肺血管重构的指标。

　　1.2.5 血浆及肺组织中AngⅡ浓度测定 处死大鼠前从动脉取血2 mL，注入预先加有抑肽酶的抗凝管中，摇匀，将低温离心机调至4 ℃，以1 000 r/min(r = 6 cm)离心15 min，分离血浆置于-20 ℃冰箱保存待测血浆AngⅡ浓度。取肺组织100 mg加入生理盐水1 mL，低温匀浆，匀浆液中加抑肽酶，煮沸10 min，3 000 r/min(r = 6 cm)离心，取上清液置于- 20 ℃冰箱保存待测。AngⅡ浓度测定采用放射免疫方法检测，严格按试剂盒说明书操作。

　　1.2.6 Western blot检测肺组织p-ERK1/2及t-ERK1/2蛋白的表达 ①肺组织蛋白的提取：取同一部位肺组织，剪碎后加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行组织匀浆，在4 ℃条件下以3 000 r/min(r = 6 cm)离心10 min，弃除沉淀，用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。②转印迹及杂交：取20 μg蛋白加入上样缓冲液，煮沸3 min后进行SDS-PAGE电泳，转PVDF 膜，分别与抗p-ERK1/2 (1：2 500)和t-ERK1/2抗体(1：2 000) 4 ℃ 孵育过夜。③显迹： 反复洗膜后，将膜与IgG抗体(1：2 000)室温孵育 1 h，用二氨基联苯胺 (DAB)显色，用Image图像分析软件分析t-ERK1/2和p-ERK1/2各条带的灰度值。以t-ERK1/2作为参照， p-ERK1/2和t-ERK1/2两者的比值代表ERK1/2的活化程度或ERK1/2的磷酸化水平。

　　1.2.7 统计学方法 各组指标以(x ± s)表示，用SPSS 11.0 软件进行统计学处理，采用单因素方差分析判定差异显著性。

　　2 结 果

　　2.1 右室收缩压及右心室肥厚指数的变化

　　与control相比， MCT组的RVSP及RVHI明显升高(P < 0.01)，说明肺动脉高压模型建立成功。与MCT组相比，MCT + Ang-(1-7)组RVSP、RVHI 均明显降低(P < 0.01)。Control组、MCT + Ang-(1-7)组、control + Ang-(1-7)组3组间RVSP、RVHI无明显差异(P > 0.05，表1)。

　　2.2 肺小动脉形态学观察

　　Control组大鼠肺血管内皮细胞连续性较好，管壁厚薄一致(图1A); MCT组大鼠肺小动脉内皮细胞肿胀、变性、坏死和脱落;血管中膜平滑肌细胞明显增生，管壁增厚，管腔变小，伴有管壁炎性细胞浸润(图1B)。MCT + Ang-(1-7)组与MCT组相比可明显抑制血管平滑肌细胞增生，抑制管壁增厚及管腔变小以及炎性细胞的浸润 (图1C)。control + Ang-(1-7)组，与control组相比管壁增厚及管腔变小无明显变化(图1D)。

　　2.3 Ang-(1-7)对肺血管重构的影响

　　MCT组肺动脉管壁厚度占管径的百分比(WT%)和肺动脉管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)明显高于control组(P < 0.01)， MCT + Ang-(1-7)组WT%和WA%明显低于MCT组(P < 0.01)。Control组、control + Ang-(1-7)组、MCT + Ang-(1-7)组3组间WT%、WA%无明显差异(P > 0.05，表1)。

　　2.4 Ang-(1-7)对血浆及肺组织AngⅡ浓度的影响

　　MCT组肺组织AngⅡ浓度高于control组、control + Ang-(1-7)组(P<0.01)， MCT组肺组织AngⅡ浓度与MCT + Ang-(1-7)组无明显差异(P > 0.05)。血浆AngⅡ浓度4组之间无明显差异(P > 0.05，表1)。

　　2.5 Ang-(1-7)对肺组织p-ERK1/2及t-ERK1/2蛋白表达的影响

　　Western blot显示，大鼠肺组织同时表达ERK1/2蛋白的两种同型体，即ERK1和ERK2，分子量分别为44 ku和42 ku。MCT组ERK1/2磷酸化水平明显高于control组(P < 0.01)， MCT + Ang-(1-7)组ERK1/2磷酸化水平明显低于MCT组(P < 0.01)，control组、control + Ang-(1-7)组、MCT + Ang-(1-7)组3组间ERK1/2磷酸化水平无明显差异(P > 0.05，图2)。

　　3 讨 论

　　我们在研究中发现，野百合碱注射4周后，右室收缩压和右心室肥厚指数明显升高，肺动脉管壁厚度占管径的百分比(WT%)和肺动脉管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)显著高于正常对照组，肺小动脉出现明显的重构。成功建立了大鼠肺动脉高压模型。AngⅡ是促进人类肺动脉血管平滑肌细胞增殖的因素之一。我们的实验中肺动脉高压大鼠与正常大鼠相比，肺组织AngⅡ浓度明显升高，而血浆AngⅡ浓度增高不明显，说明局部组织RAS激活在血管重构中起了重要作用。

　　Ang-(1-7)是RAS的新成员，它与其特异的G蛋白偶联受体Mas相结合，构成Ang-(1-7)-Mas轴，产生扩血管及抗增殖的生物学效应，对抗AngⅡ的作用[9]。Ang-(1-7)由AngⅠ(在中性内肽酶作用下)和AngⅡ(在脯氨酰羧肽酶作用下)降解产生。最近的研究证实： AngⅠ和AngⅡ可在ACE2作用下生成Ang-(1-7)[10]。心脏和血管是Ang-(1-7)形成和发挥生物学作用的靶器官。研究证实，Ang-(1-7)可扩张犬和猪的冠状动脉，犬的脑动脉，兔的入球小动脉，大鼠的主动脉，正常血压和高血压大鼠的肠系膜动脉等[11]。但在人的前臂血管却发现了相冲突的结果。可见不同的物种和血管床中，Ang-(1-7)生物学作用可能存在差异。在野百合碱诱导的肺动脉高压模型中，Ang-(1-7) 能否抑制肺动脉高压的发生及肺血管重构，目前尚无文献报道。由于Ang-(1-7)在体内的半衰期很短(约9 s)，根据渗透压的原理，微渗泵可将泵内的药物以恒定的速度释放出，因此我们采用微渗泵通过静脉持续输注的方式给药。关于Ang-(1-7)剂量的选择，我们采用了国内外文献中所使用的剂量24 ?滋g/(kg•h)[7]。正常的大鼠给予外源性泵入Ang-(1-7) 4周后，右室收缩压和右心室肥厚指数与正常对照组相比无明显的变化。野百合碱注射后，外源性泵入Ang-(1-7)治疗4周，与野百合碱组比较右室收缩压和右心室肥厚指数明显升高可显著降低，表明Ang-(1-7)可预防野百合碱诱导的肺动脉高压的发生。

　　Ang-(1-7)可以抑制由胎牛血清、血小板源性生长因子、AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞的增殖[12]，Ang-(1-7)可以抑制大鼠颈动脉球囊损伤导致的内膜增生以及大鼠腹主动脉支架植入后的内膜增生和再狭窄[13]。在我们的实验中，Ang-(1-7)对正常的大鼠肺血管无明显影响。WT%和WA%与正常对照组相比无明显的变化。野百合碱注射后给予Ang-(1-7)则可明显抑制肺血管的重构，WT%和WA%明显低于MCT组。MAPKs家族成员所主导的信号通路是将细胞外生物信号转入核内，在细胞生长、增殖、分化的调节中起重要作用，其中以ERK1/2与细胞的增殖反应最为密切[14]。ERK1/2受到多种生长因子、细胞因子和一些血管活性物质刺激后，通过磷酸化202位苏氨酸和204位酪氨酸，转化为其活性形式，即P-ERK1/2。P-ERK1/2再从细胞浆转位进入细胞核内，激活多种早期转录调节基因，启动和促进细胞增殖相关蛋白质基因的转录和表达，引起细胞增殖、促进蛋白质和胶原的合成等[15]。Gallagher和Tallant[16]证实Ang-(1-7)可以通过抑制ERK1/2这条信号通路而抑制肺癌细胞的生长。Ang-(1-7)可以通过下调ERK1/2的磷酸化水平抑制胎牛血清、血小板源性生长因子、AngⅡ诱导的血管血管平滑肌细胞的增殖[12]。我们的实验中野百合碱组肺小动脉出现明显的重构，同时肺组织ERK1/2蛋白磷酸化水平明显上调。野百合碱注射后给予Ang-(1-7)，使肺组织ERK1/2蛋白磷酸化水平下降，提示下调ERK1/2的磷酸化水平与抑制肺血管重构密切相关。Ang-(1-7)抑制了ERK1/2的磷酸化，导致p-ERK1/2入核减少，使其下游细胞增殖的因子表达减少，从而抑制血管平滑肌细胞的增殖。肺动脉高压的治疗目前是仍然是临床上的难点，在MCT诱导的肺动脉高压模型中，我们发现Ang-(1-7)可能通过降低ERK1/2磷酸化水平，抑制肺血管的重构，预防肺动脉高压的发生。希望能为肺动脉高压治疗提供新的思路。

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