高糖诱导人脐静脉内皮细胞内皮微粒释放并促进细胞凋亡

　　作者：田刚,任燕,卢群,鲁敏　　作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院心内科，陕西西安

　　【摘要】目的 探讨高糖对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)内皮微粒释放和细胞凋亡的影响。方法 用不同浓度的葡萄糖(5.5mmol/L、16.7mmol/L和33.3mmol/L)分别作用于培养成功的HUVEC 0、12、24、48、72h，设立正常糖浓度组(5.5mmol/L葡萄糖)和高渗对照组(27.8mmol/L甘露醇)作为对照。应用MTT比色法检测细胞的生存率;采用流式细胞仪分别检测HUVEC内皮微粒的释放水平以及细胞凋亡率。结果 ①MTT检测发现，33.3mmol/L葡萄糖培养12h时HUVEC的细胞数比为93%，24h时为78%，48h时为51%，72h时为40%;与0h组相比，12h组细胞数比下降但无统计学意义(P>0.05);与12h相比，24h组、48h组和72h组细胞数比显著下降，且呈时间依赖性减低(P均<0.05)。②设5.5mmol/L正常糖浓度组培养48h时的HUVEC细胞数比为100%，则高渗对照组HUVEC细胞数比为98%，与正常糖浓度对照组比较无统计学差异(P>0.05);16.7mmol/L葡萄糖组和33.3mmol/L葡萄糖组的细胞数比分别为79%和51%，均明显低于正常糖浓度组(P均<0.05)，且前两组相比亦存在统计学差异(P<0.05)。③33.3mmol/L葡萄糖组作用12h时的HUVEC内皮微粒生成量较正常糖浓度对照组明显增加(P<0.05)，24、48、72h时增加更为显著，且呈现时间依赖性(P<0.01);与正常糖浓度对照组相比，高渗对照组12、24、48、72h时其内皮微粒释放水平无统计学差异(P>0.05);④高糖诱导的内皮微粒释放水平与细胞凋亡率呈正相关(r=0.659, P<0.05)。结论 高糖刺激诱导人脐静脉内皮细胞内皮微粒释放，促进细胞凋亡。

　　【关键词】 葡萄糖,糖尿病,动脉粥样硬化;内皮微粒;内皮功能

　　ABSTRACT: Objective To explore the effects of high glucose on release of endothelial microparticles (EMPs) and cell apoptosis in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods HUVECs were incubated for 0h, 12h, 24h, 48h and 72h, respectively, with different concentrations of glucose (5.5mmol/L, 16.7mmol/L and 33.3mmol/L, respectively). The cells cultured in the media containing glucose 5.5mmol/L and mannitol 27.8mmol/L served as control groups. The survival rate of cells was examined by MTT assay. The level of EMPs release and percentage of cell apoptosis were detected by flow cytometry. Results ① According to MTT detection, the survival rate of HUVECs was 93% when incubated for 12h with 33.3mmol/L, 78% for 24h, 51% for 48h, and 40% for 72h. Compared with that for 0h, the survival rate for 12h did not decline significantly (P>0.05). the survival rate reduced significantly for 24, 48 and 72h, respectively, in the timedependent manner (P<0.05). ② If the survival rate was 100% when incubated in 5.5mmol/L glucose for 48h, then it was 98% in mannitol 27.8mmol/L with no significant difference (P>0.05). It was 79% in 16.7mmol/L glucose and 51% in 33.3mmol/L glucose, obviously lower than that in 5.5mmol/L glucose, and the two groups differed significantly (P<0.05). ③ the level of EMPs release increased significantly in 33.3mmol/L glucose for 12, 24, 48 and 72h respectively, in the timedependent manner. Compared with the normal glucose group, the level of EMPs release did not significantly differ in mannitol 27.8mmol/L for 12, 24, 48 and 72h , respectively (P>0.05). ④ There was a significantly positive correlation between EMPs release and cell apoptosis (r=0.659, P<0.05). Conclusion High glucose induces release of HUVECs endothelial miccroparticles and promotes cell apoptosis.

　　KEY WORDS: glucose; diabetes; atherosclerosis; endothelial microparticle; endothelial function

　　完整的单层内皮细胞屏障在维持血管的正常结构、功能及抗粥样硬化中起着关键作用。血管内皮功能障碍是糖尿病血管病变发生的主要因素之一[1]。但是，高血糖导致血管内皮功能异常、促进动脉粥样硬化(AS)进展的确切机制仍不明确。内皮微粒(endothelial microparticles, EMPs)是内皮细胞活化或凋亡时从其表面释放的亚微米级颗粒，其作为反映内皮细胞功能的新标记物,在炎症反应、AS等多种疾病中可能起着重要的作用[23]。目前有关高糖刺激与EMPs释放，进而导致内皮功能损伤，促进动脉粥样硬化的发生和发展的研究，国内外鲜有报道。本研究以培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)为研究对象，观察高浓度葡萄糖刺激对EMPs释放和内皮细胞凋亡的影响，为深入研究糖尿病内皮功能异常与血管病变的关系提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人脐静脉内皮细胞株(Cambrex Bio Science Walkersville公司);L葡萄糖、胰蛋白酶和噻唑蓝(MTT)(GIBCO公司);胎牛血清(HyClone公司);PEANTI CD144抗体(eBioscience公司);丫啶橙/溴乙锭(Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO)和Annexin VFITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(北京北方伟业发展有限公司);一氧化氮测试盒(南京建成生物工程研究所)。倒置显微镜(日本OLYMPUS CK40);酶标仪(Biotek产品)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　HUVEC用含200mL/L胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、50mL/L CO2条件下进行培养，瓶底被细胞铺满80%时，用2.5g/L胰酶消化、传代。将生长良好的内皮细胞以2.5×105/mL接种于6孔培养板，2mL/孔。台盼蓝细胞存活染色方法检测示细胞存活〉95%，待次日细胞贴壁后，改用无血清的DMEM培养基培养8h后开始实验分组。

　　1.2.2 实验分组

　　参照以往文献[4]，将HUVEC分为4组，每组设6个平行孔(n=6)：高渗对照组(27.8mmol/L甘露醇);正常糖浓度对照组(5.5mmol/L);高糖组(分别为16.7mmol/L和33.3mmol/L)。

　　1.2.3 HUVEC生存率的检测(MTT比色法)

　　细胞培养至所选时间，弃上清，每孔依次加入DMEM、MTT溶液20μL(5mg/mL)，继续培养4h，弃培养上清液;每孔加入DMSO 150μL，置37℃水浴摇床均匀震荡10min，室温放置10min，使结晶物充分溶解;用酶标仪在490nm波长处测定其吸光度(A)值。按下列公式[6]计算细胞数比：细胞数比=实验组A值对照组A值×100%

　　1.2.4 细胞凋亡检测(Annexin VFITC/PI双染色法)

　　按说明书进行操作。收集细胞(1×106细胞/每组)，冰PBS清洗细胞2次，弃上清液;将细胞重悬于195μL结合缓冲液中，显微镜下细胞计数，调整细胞浓度为2～5×105/mL;取细胞悬液195μL，加入5μL F1TCAnnexin V混合，室温孵育10min，离心，PBS洗涤细胞，弃上清液;再使用190μL结合缓冲液重悬细胞，加入10μL PI复合染液(终质量浓度为1μg/mL)避光染色20min后行流式细胞仪检测。

　　1.2.5 细胞凋亡指数的测定(吖啶橙/溴乙锭荧光染色法)

　　在分装有1μL丫啶橙/溴乙锭混合液的试管内加入25μL细胞悬液，轻轻摇匀(所加溶液均置管底)，置室温5～10min;将此混悬液取出10μL置于洁净载玻片上，加盖玻片，用荧光显微镜观察。Cell Quest软件获取单个细胞200个，并分别计数下列4种细胞状态的各自数目：①具有正常核的细胞(VN，明亮的绿色染色质，且具正常的结构);②含有凋亡核的活细胞(VA，明亮的绿色荧光，且呈高度聚集或断裂);③具有正常核的死细胞(NVN，明亮的染色质，具有正常结构);④具有凋亡核的死细胞(NVA，明亮的染色质，高度聚集或断裂)。按下式计算凋亡指数：凋亡细胞百分比(凋亡指数)=VA+NVAVN+VA+NVN+NVA×100%

　　1.2.6 HUVEC内皮微粒(CD144)释放的检测

　　细胞培养至所选时间，收获培养上清液转移至50mL锥管中;5000r/min离心10min;收集培养上清液，100000r/min离心120min，弃上清;加入PBS 1mL悬浮细胞;加入特异性荧光标记抗体PEANTICD144抗体0.5μg，37℃水浴，避光孵育30min后加入1mL PBS液，流式细胞仪检测。每组实验重复3次。内皮微粒定义为1.0μm以下CD144阳性的微粒。

　　1.3 统计学处理

　　所得数据均用SPSS 13.0软件包进行统计处理。计量资料采用均数±标准差(±s)表示，数据符合正态分布并经方差齐性检验，多组间均数差异用方差分析;两组样本均数间比较用t检验，双侧检验;相关性分析用PEARSON相关分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 葡萄糖对HUVEC的损伤

　　2.1.1 高葡萄糖培养不同时间对HUVECs细胞生存率的影响

　　细胞生存率MTT检测发现，设高葡萄糖(33.3mmol/L)培养0h组的HUVEC细胞活力为100%，则高葡萄糖培养12h时，HUVEC细胞数比为93%，24h时为78%，48h时为51%，72h时为40%。与0h组相比，12h组细胞数比下降但无统计学意义(P>0.05);与12h相比，24h组、48h组和72h组细胞数比显著下降，且呈时间依赖性减低(P均<0.05，图1)。

　　2.1.2 不同浓度葡萄糖对HUVEC细胞生存率的影响

　　MTT检测发现，设5.5mmol/L正常葡萄糖培养48h时的HUVEC细胞数比为100%，则高渗对照组HUVEC的细胞数比为98%，与正常糖浓度对照组相比无统计学差异(P>0.05);16.7mmol/L葡萄糖培养时为79%，33.3mmol/L葡萄糖培养时为51%，均明显低于正常葡萄糖培养时(P均<0.05)，且33.3mmol/L葡萄糖组与16.7mmol/L葡萄糖组相比细胞数比亦存在统计学差异(P<0.05，图2)。

　　2.2 葡萄糖诱导HUVEC内皮微粒释放的量时效应

　　2.2.1 不同浓度葡萄糖对HUVEC内皮微粒释放的影响

　　与5.5mmol/L正常葡萄糖培养48h比较，随着葡萄糖浓度的增加，细胞内皮微粒释放水平呈现浓度依赖性增加(P<0.05)。与正常糖浓度对照组相比，高渗对照组内皮微粒释放水平均无统计学差异(P>0.05，图3)。鉴于33.3mmol/L糖浓度对内皮微粒释放的影响尤为明显(P<0.01)，故选择该浓度观察高糖作用时间对内皮微粒释放的影响。

　　2.2.2 高葡萄糖培养不同时间对HUVEC内皮微粒释放的影响

　　在高浓度葡萄糖(33.3mmol/L)作用12h时HUVEC内皮微粒生成量较正常糖浓度对照组明显增加(P<0.05);在24、48h以及72h时则显著增加，且呈现时间依赖性(P<0.01)。与正常糖浓度对照组相比，高渗对照组在12、24、48h及72h时其内皮微粒释放水平均无统计学差异(P>0.05，图4)。结果提示，高浓度葡萄糖诱导的HUVEC内皮微粒释放水平与葡萄糖浓度和作用时间呈正相关，与高葡萄糖产生的高渗作用无关。

　　2.3 细胞凋亡率

　　高糖培养的HUVEC细胞24h时的细胞凋亡率较正常糖浓度对照组显著增高(P<0.05)，且随着葡萄糖浓度的增加以及作用时间的延长，凋亡率逐渐升高,其中高浓度葡萄糖(33.3mmol/L)组作用72h时细胞凋亡率最高(表1)。高糖诱导的内皮微粒释放水平与细胞凋亡率呈正相关(r=0.659，P<0.05)。表1 不同浓度葡萄糖对HUVEC凋亡率的量时效应(略)

　　3 讨 论

　　内皮细胞功能不全不仅是糖尿病血管病变和动脉粥样硬化等各种心血管疾病发生发展的始动因素，也是多种心脏病或炎症性疾病累及心血管系统的最终结果[56]。内皮功能障碍是个系统的、可逆的过程。因此，准确评价及早期改善内皮功能对延缓心血管并发症的发生有重要意义，也是当今心血管疾病诊治的主要方向之一。EMPs是内皮细胞激活与损伤的产物，能直接反映其来源细胞的功能状态，是新近提出的评价内皮功能障碍的指标[78]。EMPs表达内皮细胞膜表面抗原，如CD31、CD144、CD51、CD54和CD105等，这些表面抗原常作为EMPs的标志用于其检测[911]。

　　MEZENTSEV等通过观察不同浓度的EMPs对血管生成各参数的影响，发现随着EMPs作用时间和浓度的增加，EMPs对内皮细胞增殖率减少和细胞凋亡率增加的影响也增强，使内皮细胞损伤修复功能下降，加重内皮功能损害。KOGA等[12]体内实验证实，CD144是表达于内皮细胞表面的一种白细胞分化抗原，可特异标记内皮细胞来源的微粒。我们采用体外培养的人脐静脉内皮细胞模型，应用PEANTICD144标记EMPs，观察内皮细胞暴露于不同浓度葡萄糖条件下EMPs的释放水平。结果发现，高浓度葡萄糖刺激24h后HUVEC内皮微粒的释放量明显增加，细胞数比下降，细胞凋亡率显著增高，并呈剂量和时间依赖关系。提示CD144标记的EMPs可以反映内皮功能障碍及其程度，与文献报道一致[13]。甘露醇组内皮微粒的释放水平与正常葡萄糖组无显著性差异，说明内皮微粒释放的改变主要是由高糖所致，与渗透压的改变无关。目前认为，高糖通过多种途径导致血管内皮细胞功能障碍。研究发现，内皮细胞凋亡是糖尿病患者血管并发症发生最初的启动因素。体外研究也证实，高糖状态下，线粒体呼吸链中氧自由基生成增加，致使舒血管物质一氧化氮(NO)利用率下降，核因子B(NFkB)活性降低，缩血管物质内皮素(ET)的生成增多，引起内皮依赖的血管舒张功能缺陷，继而导致微血管和大血管合并症的发生。

　　与血小板相似，内皮细胞在生理状况下也可囊泡化产生EMPs[14]。但在疾病状态下，EMPs数量的明显增加，主要是内皮细胞受激活剂活化或凋亡的结果[15]。NO在调节内皮细胞功能中起着重要的作用，并参与内皮细胞与血液各成分及血管平滑肌细胞的相互作用。BRODSKY等[16]的实验证明，EMPs可减弱乙酰胆碱介导的血管舒张，减少小鼠主动脉NO的释放，增加其过氧化物的产生，这些效应与EMPs的浓度呈正相关。该现象的可能机制是EMPs本身产生的过氧化物和NAD(P)H氧化酶使内皮细胞一氧化氮合酶解耦联，其产物由NO转变为过氧化物，从而导致血管内皮的损伤。本研究观察到，高浓度葡萄糖诱导HUVEC内皮微粒的释放水平与细胞凋亡率呈正相关;甘露醇组细胞凋亡率则无显著性差异。该结果提示，是高糖本身或其反应产物引起细胞内皮微粒的释放水平的改变，并进一步导致细胞损伤。

　　在高糖状态下，影响HUVEC凋亡以及功能障碍的因素较多，调节机制复杂。EMPs的水平与性质可反映其来源内皮细胞的功能状态。因此，对EMPs在促凝、促炎反应，加重内皮功能障碍和促进血管生成等方面的作用将是今后心血管领域探讨的热点之一。

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