阿托伐他汀对高胆固醇血症患者AT1表达的影响

　　作者：李永红,葛志明,王其新,蔡尚郎,董果雄　　作者单位：青岛大学医学院附属医院心内科，山东 青岛 266061

　　【摘要】 目的通过观察高胆固醇血症患者血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型受体(AT1)表达的变化及阿托伐他汀对其表达变化的影响，探讨肾素血管紧张素系统(RAS)在动脉粥样硬化(AS)发生的作用及他汀多效性作用的机制。方法 在该院健康查体中心随机选取健康对照者40例和高胆固醇血症患者60例，分别为对照组和高脂组;高脂组予以阿托伐他汀20 mg/d，睡前口服，共12 w。对照组、高脂组他汀治疗前及治疗后，肘静脉取血，分离血清、血浆并提取血小板。放射免疫分析法检测血浆的AngⅡ水平，RTPCR和Western印迹方法分别检测血小板AT1的mRNA和蛋白质表达水平。结果 ①高脂组治疗前的血浆AngⅡ水平较对照组明显升高〔(92.13±22.27)pg/ml vs(50.85±12.15)pg/ml〕(P<0.01)，治疗后的血浆AngⅡ水平较治疗前明显降低〔(78.57±18.33)pg/ml vs(92.13±22.27)pg/ml〕(P<0.05)。② 高脂组治疗前血小板的AT1 mRNA和蛋白质表达较对照组明显升高〔0.93±0.22 vs 0.25±0.06(P<0.01)和1.35±0.32 vs 0.42±0.10(P<0.01)〕，治疗后血小板的AT1 mRNA和蛋白质表达较治疗前明显降低〔(0.52±0.13 vs 0.93±0.22(P<0.01)和0.72±0.16 vs 1.35±0.32(P<0.01)〕。③高脂组治疗前AngⅡ与AT1表达的相关分析显示，AT1表达与血浆的AngⅡ呈显著正相关(r=0.607，P<0.01)。结论 阿托伐他汀下调高胆固醇血症患者血小板AT1表达的增高。

　　【关键词】 动脉粥样硬化,血小板,血管紧张素Ⅱ1型受体,阿托伐他汀

　　冠心病、脑卒中是常见的老年心脑血管疾病，动脉粥样硬化(AS)是其主要原因，其发生发展过程中存在一系列的致病危险因素，如高脂血症、高血压、糖尿病等。大量研究证实肾素血管紧张素系统(RAS)参与了AS的发生过程〔1〕。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性成分，不仅具有收缩血管、促进细胞增殖的作用，并能通过诱导炎症反应及细胞凋亡，促进氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)摄取、产生氧自由基和影响纤溶功能等多方面参与AS的病理过程，而且AngⅡ的这些生物学作用多是通过其1型受体(AT1)实现的。他汀类药物是3羟基3甲基戊二酸单酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂，不仅具有调节血脂的作用，而且还具有改善血管内皮功能、抑制炎性介质释放及血小板活化、延迟AS进程等调脂外的作用，即多效性作用，但关于他汀对高胆固醇血症患者AT1 mRNA和蛋白质表达变化的影响，国内尚未见有报道，本课题对此进行了探讨。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象及分组

　　选取2005年5月～2006年1月在本院健康查体中心查体的男性高胆固醇血症患者60例(高脂组)，年龄43.8～69.2(平均56.5±12.7)岁。入选标准为总胆固醇(TC)>6.24 mmol/L(240 mg/dl)，同时临床上排除继发性高胆固醇血症(包括甲状腺、肝胆、肾疾患、糖尿病等)，而且入选前3个月内无急性心肌梗死、高血压、心绞痛和脑血管意外，至少1月内未用过调脂药、抗血小板药、钙拮抗剂、硝酸脂类及影响RAS的药物。正常对照组40例(对照组)，年龄43.1～74.3(平均58.7±15.6)岁，均为健康查体者，2 w内未服用任何药物。所有病人对实验的过程均知晓同意。高脂组患者给予阿托伐他汀(立普妥，购自辉瑞制药有限公司)20 mg/d睡前口服，共12 w。对照组、高脂组立普妥治疗前及治疗后12 w分别自肘静脉取血进行检测。高脂组60人，按要求坚持服用立普妥12 w并完成实验者56人。患者退出实验的原因：1例出现乏力，转氨酶升高3倍，1 w时退出实验;其余3例因依从性差而中途退出。

　　1.2 血脂检测

　　全自动生化仪检测血清TC、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平。

　　1.3 血浆AngⅡ的检测

　　放射免疫分析法(试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所)检测血浆AngⅡ水平。

　　1.4 血小板提取

　　EDTA抗凝血1 500 r/min离心10 min，取上层富含血小板血浆4℃，3 500 r/min离心10 min，生理盐水洗2次，沉淀即血小板。

　　1.5 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)

　　①RNA提取：血小板沉淀，加入Trizol试剂(美国，Invitrogen公司)1 ml，再经氯仿、异丙醇提取总RNA。紫外分光光度计测定RNA的A260/A280，确定其纯度。所有实验样品的 A260/A280均大于1.7。②RTPCR：逆转录反应(RT)根据逆转录试剂盒(美国，Promega公司)要求的标准进行。反应条件为：42℃×1 h，95℃×5 min。聚合酶链反应(PCR)中AT1和内参照βactin引物根据其基因库中的基因序列由Primer primer 5软件自行设计。引物序列及扩增条件同既往的研究〔2〕。③电泳：1.5%琼脂糖凝胶电泳，稳压120 V，时间15 min左右，凝胶成像分析仪观察并拍照，同时输入计算机并存储。④结果分析：利用图像分析软件进行分析。将每份标本的AT1与内参照βactin扩增条带的平均光密度比作为AT1 mRNA含量的相对值。

　　1.6 Western印迹

　　蛋白提取液提取的血小板膜蛋白，煮沸5 min后上样;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及电转膜后，分别加入稀释的AT1抗体(1∶50)和Actin抗体(1∶500)进行一抗反应，然后再行二抗反应(1∶1 250稀释)及DAB显色。数字凝胶成像分析系统对Western印迹的电泳条带进行分析。将目的蛋白与内参照Actin电泳条带的平均光密度比作为其蛋白含量的相对值。

　　1.7 统计学处理

　　所有数据均采用x±s表示，采用SPSS 12.0分析软件，计量资料分析采用方差分析，变量间的相关关系采用Excel软件进行直线相关分析。

　　2 结果

　　2.1 血脂检测结果

　　高脂组治疗前的TC、TG和LDL水平较对照组明显升高(P<0.01)，治疗后较治疗前明显降低(P<0.05)，并恢复到对照组水平。高脂组治疗前的HDL水平明显低于对照组(P<0.01)，治疗后较治疗前明显升高(P<0.05)。见表1。

　　2.2 血浆AngⅡ水平的变化

　　与对照组相比，高脂组治疗前的血浆AngⅡ水平明显增高(P<0.01)，治疗后较治疗前明显降低(P<0.05)。见表1。表1 血清脂质、血浆AngⅡ及血小板AT1mRNA及蛋白质的表达水平(略)

　　2.3 RTPCR的检测结果

　　PCR扩增的AT1片段长度与预期相符，为350 bp。对照组的血小板AT1 mRNA表达较低;高脂组治疗前的AT1表达水平较对照组明显升高(P<0.01);他汀治疗后的表达水平较治疗前明显降低(P<0.01)。见表1及图1A。

　　2.4 Western印迹检测结果

　　如表1及图1B。AT1的蛋白质分子量为50 kD。对照组血小板AT1蛋白表达较低;高脂组治疗前AT1表达水平较对照组明显升高(P<0.01);他汀治疗后较治疗前明显降低(P<0.01)。

　　2.5 相关分析的结果

　　高脂组治疗前的AT1蛋白表达与血浆AngⅡ浓度呈显著正相关(r=0.607，P<0.01)。

　　3 讨论

　　大量的临床流行病学资料都一致证明，血清TC浓度是AS性心、脑血管疾病的重要危险因素，积极降脂是防治AS的有效手段。许多研究已证实RAS参与了AS的发生过程〔1〕。AngⅡ是RAS的主要活性成分，能通过诱导炎症反应、促进细胞凋亡、促进LDL氧化和转移、产生氧自由基、影响纤溶功能等机制，参与AS的病理过程。

　　AngⅡ的生物学作用是通过与各种组织细胞膜上的特异性血管紧张素Ⅱ受体(ATR)结合实现的，目前研究较多的是AT1和AT2两个亚型，它们的分布、结构、功能均不相同。几乎AngⅡ的所有对成年组织的效应均由AT1介导，AT2功能目前尚未完全阐明，在生理状态下能通过抑制细胞生长、诱导凋亡和引起血管舒张拮抗AT1的作用〔3〕。

　　血小板的主要功能是止血和血栓形成，高脂血症时由于内皮细胞损伤而激活血小板。研究证实，血小板活化释放的一些介质直接参与AS的形成和发展。循环中的血小板虽然没有细胞核，但是含有来源于巨核细胞的少量残余mRNA，而且部分能被翻译为蛋白质〔4〕。血液中含有丰富的血小板，取材方便，但目前国内有关血小板mRNA表达的研究较少。

　　本研究结果显示，高胆固醇血症患者AngⅡ产生增加，血小板AT1表达上调，阿托伐他汀能明显降低高胆固醇血症患者血浆的AngⅡ水平和AT1的表达。对AngⅡ与AT1表达的相关性分析也表明，高胆固醇血症患者AT1的表达与血浆的AngⅡ水平呈显著正相关。提示：血小板的mRNA表达水平与机体的生理及病理状态相关，而且其AT1蛋白表达的上调与AngⅡ的刺激有关。

　　AngⅡ和AT1表达增加具有促AS的作用〔5〕，其可能的机制为：①促进炎症反应，AngⅡ与AT1受体结合后，激活内皮细胞膜上的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)氧化酶，引起O2 的释放，O2 可以攻击生物膜产生脂质自由基，自由基通过氧化还原敏感的信号传递功能，使NFκB活化，炎症反应过程增强〔6〕。②损伤血管内皮：AngⅡ可以导致NO生成减少，使NO/O2 之间的平衡失调，内皮细胞受损。另外，NADP/NADPH氧化酶诱导产生的过量O2可以攻击生物膜产生脂质自由基及降解产物丙二醛，破坏内皮细胞而加重血管内皮损伤〔7〕。③促进血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和迁移，Ang Ⅱ可以诱导VSMC由收缩型向合成型转化并不断增殖和迁移，吞噬脂质，形成AS。

　　他汀类药物是近十几年开发的HMGCoA还原酶抑制剂，能有效地降低LDLC及提高HDLC。近来的研究显示除了降脂作用外，他汀类药物还有抗AS的多效性作用，主要包括抗炎、抗氧化、改善血管内皮功能、抑制血小板活化及稳定斑块等作用〔8〕。

　　Nickening等〔9〕于1999年证实他汀类药物可下调高胆固醇血症患者的AT1受体密度，并能逆转AngⅡ引起的血压升高，说明他汀类药物抗AS的多效性作用与RAS有关。本研究的结果显示：阿托伐他汀在明显降低高胆固醇血症患者血浆AngⅡ水平的同时，下调血小板AT1 mRNA和蛋白质表达。提示阿托伐他汀能通过减少AngⅡ产生，下调AT1表达发挥其抗AS的多效性作用。

　　总之，本研究显示RAS与AS的形成密切相关，AngⅡ及其AT1受体可能在AS的形成中发挥重要作用。阿托伐他汀可能通过减少AngⅡ的产生，抑制AT1的表达而拮抗RAS的促AS作用，有效阻止AS的进展。

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　　2 李永红，葛志明，王其新，等.高脂血症患者血浆血管紧张素Ⅱ水平与其血小板1型受体表达的相关性〔J〕.中国动脉硬化杂志，2007;15(3)：16972.

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　　9 Nickening G，Baumer AT，Temur Y,et al.Statinsensitive dysregulated AT1 receptor function and density in hypercholesterolemic men〔J〕. Circulation，1999;100(21):21314.