S1P2受体shRNA腺病毒载体的构建及筛选

　　作者：闾宏伟,陈淑华,阳国平,朱晒红,邓昊　　作者单位：中南大学湘雅三医院医学实验中心，湖南 长沙 410013

　　【摘要】目的为探讨S1P2受体介导血管内皮细胞衰老的机制，构建和筛选特异性S1P2受体shRNA腺病毒载体。方法 设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸(ss oligo)，经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pRNATH1.1/Shuttle载体，测序正确后经脂质体介导转染人肺动脉内皮细胞(HPAEC)，通过RTPCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNATH1.1/ShuttleshRNA，提取质粒DNA，经双酶切，回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段，亚克隆到腺病毒表达载体(pAdenoX)，筛选出正确重组子，转染HEK 293A细胞，收集重组的腺病毒，测定病毒滴度，通过Western blot方法检测S1P2受体沉默效果。结果 测序结果证实所构建的pRNATH1.1/ShuttleshRNA质粒正确，并从4对ds oligos筛选出对S1P2受体沉默效果最佳的穿梭质粒pRNATH1.1/ShuttleshRNA，经亚克隆到腺病毒表达载体。转染人肺动脉内皮细胞后，Western印迹检测显示构建的腺病毒载体pAdenoshRNA对S1P2受体蛋白的沉默有明显效果。结论 成功地构建和筛选出介导特异性shRNAS1P2的重组腺病毒。

　　【关键词】 重组腺病毒,S1P2受体;短发夹RNA,人肺动脉内皮细胞

　　【Abstract】 Objective To construct and screen the recombinant adenovirus vector with S1P2 receptortargeted shRNA for studing the mechanisms of S1P2 receptormediated aging of vascular endothelial cells (ECs). Methods 4 pairs of complementary single stranded oligonucleotides (ss oligo) were designed and synthesized and then were annealed to create a double stranded oligonucleotide (ds oligo). The ds oligos were cloned into pRNATH1.1/Shuttle vector and transduced into human pulmonary artery endothelial cells (HPAECs) after checking the correct sequence. By RTPCR the shuttle plasmids pRNATH1.1/ShuttleshRNA were acquired, extracted DNA plasmids then cut by doubleenzyme and retrieved the segment with the best silence effect on S1P2 receptorshRNA. Then the obtained recombinant plasmids were transformed into adenovirus vectorpAdenoX to screen the correct recombinant plasmids,be transformed into HEK293 cells to measure the titre of adenovirus. The silence effect of S1P2 were detected by Western blot. Results The recombinant plasmids pRNATH1.1/ShuttleshRNA were constructed and confirmed by sequencing, and the best recombinant plasmids with silence effect against S1P2 receptor was screened and was subcloned into adenovirus vector. The recombinant adenovirus mediated shRNA against S1P2 was constructed and transfected to HPAEC. The significant silence of S1P2 expression was identified by Western blot after transfected HPAECs. Conclusions The recombinant adenovirus vector with S1P2targeted shRNAs is successfully constructed and screened.

　　【Key words】 Recombinant adenovirus; S1P2 receptor; Short hairpin RNA(shRNA); Human pulmonary artery endothelial cells (HPAECs)

　　衰老是心血管疾病的主要风险因子之一，血管内皮功能的改变在血管老化中发生最早，作为早期的病理生理改变，衰老所致的血管内皮功能障碍，在心血管疾病的发生发展过程中起着重要作用。血浆中的1磷酸鞘氨醇(S1P)对内皮细胞功能产生极为重要的影响，S1P作用于血管内皮细胞表面S1P受体，产生广泛的生物学效应，在心血管系统方面发挥重要作用。我们前期的研究表明了S1P2受体在衰老血管内皮细胞中的表达上调与内皮细胞迁移及血管生成能力等功能下调改变相关联(资料另发表);本研究将通过构建和筛选S1P2受体基因短发夹RNA(shRNA)的重组腺病毒载体，为进一步研究S1P2受体介导血管内皮细胞衰老机制奠定基础。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料 穿梭质粒pRNATH1.1/Shuttle载体由美国Ggenscript公司提供;腺病毒表达载体AdenoXTM Expression System Ⅰ 由美国 Clontech 公司提供;Lipofectamine 2000脂质体和包装细胞 HEK 293A由美国Invitrogen 公司提供;E.coli DH5α菌株由武汉晶赛生物公司提供;质粒 DNA抽提胶回收试剂盒和小规模质粒DNA 提取纯化试剂盒由中鼎生物技术有限公司提供;T4 DNA ligase 连接酶及各种核酸限制性内切酶由美国 NEB公司提供;PCR Buffer、rTaq、DNA Marker 由大连宝生物工程有限公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 采用Clontech RNAi Designer设计软件，设计5对shRNA序列，两端分别加HindⅢ和BamHⅠ酶切位点;shRNA的DNA片段、S1P2和βactin引物见(表1)。

　　Oligo正义链中TTCAAGAGA序列和反义链中TCTCTTGAA序列为 shRNA的茎环结构，小写英文字母序列为酶切位点。以上序列由Invitrogen公司合成。

　　表1 干涉靶点的选取(略)

　　1.2.2 pRNATH1.1/ShuttleshRNA重组质粒的构建及鉴定 将合成的ss oligos稀释到 20 μmol/L，每对ss oligos经 95℃变性 2 min，常温退火，得到 ds oligos。将ds oligos(shRNA)与pRNATH1.1/Shuttle载体同时经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接得到pRNATH1.1/ShuttleshRNA，转化到DH5α感受态细菌，经过氨苄青霉素抗性筛选后，挑选阳性克隆培养，提取质粒DNA，酶切和PCR鉴定阳性克隆并测序，证实shRNA序列。

　　1.2.3 pRNATH1.1/ShuttleshRNA质粒转染人肺动脉内皮细胞系及RTPCR筛选 取 Lipofectamine 2000脂质体 10 μl，按说明书操作。转染pRNATH1.1/ShuttleshRNA质粒DNA到人肺动脉内皮细胞系(HPAEC)，转染48 h后，参照 Trizol 说明书提取细胞总RNA，RTPCR检测S1P2受体的表达，以未转染的HPAEC细胞为正常组，转染空载体的HPAEC细胞为阴性对照，筛选有沉默效果的shRNA序列，平行实验重复3次。

　　1.2.4 重组腺病毒的构建及其滴度测定 筛选获得的阳性克隆pRNATH1.1/ShuttleshRNA穿梭质粒，经培养和提取质粒DNA，经PISce和ICeuⅠ双酶切，回收shRNA序列片段，亚克隆到腺病毒表达载体(pAdenoX)，SwaⅠ酶切，转化到DH5α感受态细菌，氨苄青霉素抗性筛选，挑选克隆培养，提取DNA，PacⅠ酶切线性化DNA，转染HEK 293细胞，收集重组的腺病毒，测定病毒滴度。

　　1.2.5 Western印迹分析重组腺病毒的沉默效果 重组腺病毒 shRNAS1P2感染HPAEC细胞48 h后，以未转染的HPAEC细胞为正常组，转染空载体的HPAEC细胞为阴性对照，Western印迹检测S1P2蛋白表达。每组内皮细胞在预冷的蛋白质抽提缓冲液 (20 mmol/L TrisCl，pH7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，1% Triton X100，10%蛋白酶抑制剂混合物，1%磷酸酶抑制剂混合物I，1%磷酸酶抑剂混合物Ⅱ)中，冰上裂解 30 min，12 000 r/m，4 ℃离心 15 min，去除细胞碎片，吸取上清液，即为细胞总蛋白质，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，立即用于蛋白质印迹分析。20 μg蛋白质在10% SDSPAGE凝胶中电泳分离，电转移至PVDF膜，印迹膜在含5% BSA的TBS缓冲液中阻断1 h，在抗S1P2一抗溶液(抗体用含5%BSA的TBS缓冲液稀释)中，4℃孵育过夜;TBST漂洗膜3次，每次10 min;在HRP标记的二抗溶液(抗体用含5% BSA的TBS缓冲液1∶5 000稀释)中室温孵育2 h，TBST漂洗膜3次，每次10 min;ECL检测、曝光、显影、定颖，获得Western印迹反应图谱。

　　1.3 统计学处理 数据用x±s表示，采用Excel软件进行统计分析，t检验。

　　2 结果

　　2.1 pRNATH1.1/ShuttleshRNA重组质粒的酶切和PCR鉴定结果 重组的pRNATH1.1/ShuttleshRNA穿梭质粒，转化到DH5α感受态细菌，氨苄青霉素抗性筛选，挑选10个单克隆培养，提取质粒DNA，酶切和PCR鉴定阳性克隆(图1)，其中1号克隆为空白质粒，余9个克隆均含有插入DNA片段;选送4个有插入DNA片段的穿梭质粒测序，证实所设计ds oligo已经正确插入pRNATH1.1/Shuttle载体中。

　　2.2 转染pRNATH1.1/ShuttleshRNA质粒到人HPAEC后，RTPCR筛选最佳沉默效果的重组质粒 将构建好的4个pRNATH1.1/ShuttleshRNA质粒和空白载体转染到人HPAEC 48 h后，RTPCR筛选最佳沉默效果的重组质粒，观察oligo1、oligo2、oligo3、oligo4和空白载体对人HPACE S1P2受体基因的沉默效果(图2)，结果显示 oligo2对S1P2基因的抑制效果最佳(P<0.05)。因此，oligo2为最优选择shRNA，后续实验只选择oligo2进行研究。

　　2.3 重组腺病毒的鉴定、包装及其滴度测定 挑选4个oligo2重组腺病毒的克隆，提取DNA，将重组腺病毒pAdshRNAS1P2经PISce和ICeuⅠ双酶切后凝胶电泳，出现30 kb和2.1 kb两条带(图3);表明目的shRNA oligo2片段已经构建到腺病毒载体。PacⅠ酶切线性化DNA，转染HEK 293A细胞，收集重组的腺病毒，测定病毒滴度。

　　M：100 bp Marker;110：10个质粒DNA的PCR扩增和双酶切电泳带

　　图1 pRNATH1.1/ShuttleshRNA重组(略)

　　质粒的酶切和PCR产物鉴定M：100 bp DNA marker;1～4：分别转染oligo1～oligo4的HPAEC细胞;5：转染空白载体的HPAEC细胞;6：未转染的HPAEC细胞

　　图2 RTPCR筛选最佳沉默效果的重组质粒(略)

　　M：DNA marker;1～4：重组腺病毒双酶切

　　图3 重组质粒pAdshRNAS1P2(略)

　　经PISce和ICeuⅠ双酶切鉴定2.4 采用Western印迹技术鉴定重组腺病毒对HPAEC细胞S1P2受体表达的沉默效果 重组腺病毒 shRNAS1P2感染HPAEC细胞48 h后，以未转染的HPAEC细胞为正常组，转染空载体的HPAEC细胞为阴性对照，Western印迹检测S1P2蛋白表达(图4)，显示重组腺病毒 shRNAS1P2感染HPAEC细胞后，S1P2受体蛋白的表达明显被抑制(P<0.05)。

　　1：重组腺病毒 shRNAS1P2感染HPAEC细胞;2：转染空载体的HPAEC细胞;3：未转染的HPAEC细胞

　　图4 Western印迹鉴定重组腺病毒对HPAEC细胞S1P2受体的沉默效果(略)

　　3 讨论

　　RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于基因功能探索和基因治疗领域。RNAi研究获得了快速发展，小或短干扰RNA(siRNA)是一类19～23个核苷酸长度的双链RNA分子，其主要在RNAi通路中起作用，干扰特异基因的表达〔1〕。近期研究表明，shRNA对靶基因的抑制效果明显优于siRNA〔2〕。

　　血浆中的S1P对内皮细胞功能产生极为重要的影响，S1P作用于血管内皮细胞表面S1P受体，产生广泛的生物学效应，在心血管系统方面发挥重要作用〔3～8〕。血管内皮功能的改变在血管老化中发生最早，衰老所致的血管内皮功能障碍，在心血管疾病的发生发展过程中起着重要作用〔9～11〕。我们前期的研究表明了S1P2受体在衰老血管内皮细胞中的表达上调与内皮细胞迁移及血管生成能力等功能下调改变相关联(资料另发表)。为进一步研究S1P2受体介导血管内皮细胞衰老机制，本实验首先通过设计并合成 4对靶向S1P2受体基因的shRNA序列，插入穿梭质粒pRNATH1.1/Shuttle载体，测序证实后经脂质体介导转染人HPAEC。通过RTPCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNATH1.1/ShuttleshRNA，提取质粒DNA，经双酶切，回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段，亚克隆到腺病毒表达载体(pAdenoX)，筛选出正确重组子，转染HEK 293A细胞，收集重组的腺病毒，测定病毒滴度，通过Western印迹方法检测S1P2受体沉默效果，获得有沉默效果的重组腺病毒载体。

　　通过本实验，我们成功地构建了沉默S1P2受体基因的重组腺病毒并予以鉴定。在体外实验通过构建好的shRNAS1P2腺病毒沉默人HPAEC的S1P2受体基因，达到抑制S1P2受体蛋白的效果，为进一步研究S1P2受体介导血管内皮细胞衰老机制奠定了基础。

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